この度はお世話になります。
今、上記のkitを用いて培養接着細胞におけるCaspase-1の活性を評価する計画でいます。
このキットにはCaspase-1の人工的な基質に蛍光が付いており、細胞にこの試薬を取り込ませたのち（具体的には30 min -1 hrほどincubationします）、細胞をフローサイトメトリーにて蛍光解析するというものです。
ただ、問題は私の細胞が接着細胞で、普段、トリプシン-EDTAでパッセージする際には、0.25%トリプシンで3 - 5 minほど処理しないと剥がれないような細胞です。（普通といえば普通かもしれませんが）
このキットは大概浮遊系の炎症細胞で用いられているような印象です。（マクロファージや樹状細胞、大腸ガンのセルラインでもみますが）
トリプシンや、トリプシン中に残存する未知のプロテアーゼがその人工基質を切断してしまわないか？等心配は尽きません。
接着細胞を今回のように試薬や薬剤で処理したのち、速やかに生細胞を回収してFACS等の解析を行ういい方法はないでしょうか？
接着細胞をトリプシンで最初にはがしておいて、その後fresh mediumに再度懸濁させた細胞をこの試薬で処理するってのもありでしょうか？ややトリッキーな気もしますし、浮遊状態で試薬を取り込んでくれるのかも疑問ですが・・アドバイスをいただけるととても嬉しいです。 |
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