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(無題) 削除/引用 No.4737-8 - 2016/01/14 (木) 01:36:13 - あqwせdfrgthyじゅいこlp 精製表は作った方がいいよ。項目は精製段階、総蛋白質量、活性、比活性、活性の回収率。精製が進むほど比活性（活性／総蛋白質量）は増加する一方、活性の回収率は下がってくる。量の多い酵素は２段階くらいで簡単にに高純度のものが得られることおおいけど、もともと存在量が少なかったり、安定性がわるく失活しやすい酵素は最終段階になると回収率数％とかもあり困難を極めることもある。いずれにせよ表つくれば、どの段階で活性のロスが大きいか、とか、どの段階で精製度が大きく上がるとか、出発材料はどのくらいの量が必要かとかわかるので、上手くいかないときの対策を立てやすい。精製段階にアフィ二ティ精製を入れたり溶出の際のグラジェントの勾配を変えるとか、安定化させるための工夫（金属イオンとか補酵素入れるとか）を検討することも必要かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.4737-7 - 2016/01/13 (水) 12:46:35 - akiko まずは吸光より先に活性を見て見ます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4737-6 - 2016/01/13 (水) 06:29:51 - akiko 「比活性」って何ですか？は私のなりすましですので無視して頂いて結構です

(無題) 削除/引用 No.4737-5 - 2016/01/13 (水) 06:24:31 - akiko おおさん比活性ってなんですか？

(無題) 削除/引用 No.4737-4 - 2016/01/13 (水) 02:44:45 - おお 活性がわかっているけど、蛋白として同定されていないものでしたら、活性を指標にしてせいせいして蛋白を同定するというのは昔よくやられたオーソドックスな手法だと思います。 蛋白の正体がわかっていたりして抗体などがあれば、ウエスタンブロットなどで追っていってもいいでしょう。 吸光度はその蛋白独自の吸収スペクトルを持っているなら(例えばGFPとかヘムのような色素をもっているとか)使えるかもしれません。が280nmではいろいろな蛋白を検出しますのでデーターはとることが多いですが特に初期の精製段階では目的のもののシグナルを同定することは難しいでしょう。アフィニティー後さらに精製するなら指標として有効かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4737-3 - 2016/01/13 (水) 02:13:04 - akiko APさん比活性ってなんですか？

(無題) 削除/引用 No.4737-2 - 2016/01/13 (水) 00:03:36 - AP 常識的には、それぞれのステップ、それぞれの画分で酵素活性を測定し、比活性を求めながら画分を選んでいく。たいていの酵素は確立された酵素活性のアッセイ系があるはず。なければ自分で作る。

酵素精製における精度確認 削除/引用 No.4737-1 - 2016/01/12 (火) 23:34:59 - akiko 酵素精製でアフィニティクロマトグラフィーをしようと思います。 そのために生体試料の段階から始めます。つまりホモジナイズから始めていくのですがそこから精製に至るまでの各段階では、どの画分に目的酵素があるかをどのようにして確認していけば良いのでしょうか？ ホモジナイズの段階でも塩析の段階でも最終的段階でも全て吸光度などで見るなどですか？それとも各段階で見るものは違いますか？

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