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(無題) 削除/引用 No.4734-21 - 2016/01/16 (土) 18:52:15 - くぁswでfrgtこlp；＠ IPのBGを減らす方法。 1.低吸着性の材質の磁気ビーズを使う。 protein A/Gビーズでなく直接共有結合出来るビーズの方がbetter。 2.反応後にビーズを洗うときに0.5M〜1.0MくらいのNaClかKClを含むbufferで１〜２回洗う。KClとかが残存してるとSDSの沈殿が生じるので、そのあとは１回は普通の塩濃度のbufferで１回洗った方がいい。 3.溶出はSDS sample bufferででなくて、ごく少量のpH2.0~2.5のTris-Glycine bufferの方がいい。 IPのバックグラウンドを無くすのは困難ですが、ある程度までは減らす事は可能です。蛋白質の同定が目的なら安定同位体標識法とLC-MS/MSを使えばかなりコンタミが混じっていても同定は可能なので、純度はあまり気にしすぎなくてもいいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.4734-20 - 2016/01/15 (金) 20:34:35 - som >[Re:18] くぁswでfrgthyじゅいこlさんは書きました : > そのバンドの分子量please. > 2本検出されるうちの1本が約17 kDa、もう1本が約14kDa です。

(無題) 削除/引用 No.4734-19 - 2016/01/15 (金) 02:40:52 - おお >[Re:9] somさんは書きました : > > > それではあまり説得力ないと思います。 > > やはりそうですよね。変な話、何％くらいであれば許容範囲でしょうか。 投稿用の図をつくってみて、ネガコンがなんとなくあるかもしれないけど、あまりクリアーでないっていう程度であればいいです。20%ぐらいでもはっきり出ていればたぶん投稿しても受け付けてくれないでしょう。ぎゃくに実質20%ぐらいでも、検出感度が至らなくってネガコンがきれいにバンドが出なくってなんていうこともあります。この辺を小手先だけでいじるのはきけんですが、弱い検出系を使う方がきれいにいく場合はあります。ただしお示しのような場合は、その前にもうちょっとバックを落とす工夫をした方がいいと思います。 > > その前に抗体無しでビーズとサンプルを混ぜて、ビーズを回収して、そのビーズから蛋白を溶出してWBしてください。でそこにくっついているなら、ビーズとサンプルを混ぜてビーズを除いたサンプルでやってもいいかもしれませんけど、あなたの蛋白がビーズに純粋に親和性があるのなら、解決方法になっていないでしょう。 > > ビーズと目的タンパクで親和性があった場合、上清を使っても目的タンパクが無い状態になっている、ということでしょうか。 たいていは上澄みにあなたの目的の蛋白はのこるでしょうけど、のこったものもビーズに直接つく可能性があるということです。これはやってみないとわかりませんが、ビーズだけをくわえてプレクリアーはした方がいいに越したことはありません。 > > PBSTのTはTweenですかTritonですか？濃度はどれくらいですか？ > > 言葉足らずでした。申し訳ありません。TはTween-20です。濃度は0.1%です。 washは1%Triton X-100かそれに~0.1%SDSが入っているものでいいんじゃないでしょうか。washの条件が緩すぎるのもノンスペの原因かと思われます。それでもバックが出るなら0.1%デオキシコール酸も加えるてもあります。

(無題) 削除/引用 No.4734-18 - 2016/01/15 (金) 00:10:52 - くぁswでfrgthyじゅいこl そのバンドの分子量please.

(無題) 削除/引用 No.4734-17 - 2016/01/14 (木) 16:43:26 - ttt > どちらの分画にも検出されるものです。修飾の差によって2本検出され、画分間で存在比が異なります。現在の結果はその存在比は反映しているのですが、二本のバンドのうちの片方が濃く検出される感じがあります（存在が多い方の画分も濃すぎ、存在がないと思われる方の画分にもやや濃いめのバンドが見られる）。 確認したいのですが、これは「バンドAとバンドBの比が分画によって異なることが一般に知られていて、それは確認されている」と言うことではなく、「細胞質とMLで存在比が異なって、バンドAとバンドBの分画毎の比は本来は一定」と言うことでしょうか？ 　その分画間のバンドの存在比はタンパクのアセチル化に依存したものだとしたら、アセチル化の状態を薬剤処理などで変えて、バンドの比がどのように変わるか観察すれば目的のものを見てるかどうか「見当」はつけられるのではないでしょうか？　例えば、HDAC6の基質であることが分かってるなら、HDAC6阻害剤の影響を見る、などです。 　もちろん、それが査読の第三者を納得させるに足るかどうかというのは別の問題ですが、少なくとも全くの暗闇で暗中模索してる状態からは少し脱することは出来る気がします。

(無題) 削除/引用 No.4734-16 - 2016/01/13 (水) 11:26:54 - som >[Re:15] tttさんは書きました : > ちなみに「二次抗体だけ」でのWBなどは試されたでしょうか？ それは試したことが無かったです。二次抗体のみで試してみて同じ位置にバンドが出れば非特異的反応ということになるということでよろしいでしょうか。IPしたものについても、IPにもWBにも同じ免疫動物の抗体を使っていますので、非特異的結合が目的タンパクの位置にある可能性はたしかにある気がします。 > fractionationをして小器官と細胞質を分けているようですが、これはホモジネートを最下層にした密度勾配遠心か何かで、浮いてきたものをML分画、最下層に留まったものを細胞質分画としてるのでしょうか？ > 件のバンドは両方の分画で検出されるのでしょうか？ 密度勾配遠心は行ってなく、単純に遠心速度のみで分画しています。 どちらの分画にも検出されるものです。修飾の差によって2本検出され、画分間で存在比が異なります。現在の結果はその存在比は反映しているのですが、二本のバンドのうちの片方が濃く検出される感じがあります（存在が多い方の画分も濃すぎ、存在がないと思われる方の画分にもやや濃いめのバンドが見られる）。

(無題) 削除/引用 No.4734-15 - 2016/01/13 (水) 10:18:47 - ttt ちなみに「二次抗体だけ」でのWBなどは試されたでしょうか？ fractionationをして小器官と細胞質を分けているようですが、これはホモジネートを最下層にした密度勾配遠心か何かで、浮いてきたものをML分画、最下層に留まったものを細胞質分画としてるのでしょうか？ 件のバンドは両方の分画で検出されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4734-14 - 2016/01/13 (水) 00:01:48 - som >[Re:12] あqswでfrgthyじゅいこlp；さんは書きました : > normal IgGも抗体だからね。なかにはサンプル中の蛋白質と反応するものも含まれていることもあるだろうし、ロットによってはそういうのが多いときもあるとおもうので、不思議じゃないとおもう。Pull-downでその蛋白質に対する抗体でウェスタンしたときはどうかな。 normal IgG の中に目的タンパクの抗体たりうるものが存在していたのだ、とも（半ば楽観的に）考えたりしています。 培養細胞ではなく組織を使っており、pull-down等は試せないです。組織を使っている分、余計に夾雑タンパクが多くなってしまっていることも懸念材料であります。 > CBBや銀染色で蛋白質染色したとき両方にあるようにみえても、ウェスタンでは片方だけとかなら、IPはできてるけど、単に運悪く、同じ分子量位置に量の多いコンタミの蛋白質が重なってるだけということでいいとおもうけど。 両方にあるように見えても片方だけ、とはどういったことでしょうか。理解が追い付かずすみません。 量の多いコンタミのタンパク質がWBにおいて検出されてしまうというのは、中年様への返信にも書いたのですが、通常のサンプルのWBにおいてもそれが目的タンパクのバンドとして検出されてしまっているということになりますよね。IPと比べ流しているタンパクの量が少ないので、無視できると考えて良いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4734-13 - 2016/01/12 (火) 23:49:48 - som >[Re:11] 中年さんは書きました : > うーん、ご覧になっているバンドは目的タンパク質ではなく、単に量が多いだけの夾雑タンパク質である可能性が否定出来ないように思います。 > IPにお使いの抗体は、IPやウエスタンで機能することが確認（もしくはメーカー保証）されているものですか？lysateそのままのストレートのウエスタンで同じサイズにバンドがでますか？そのバンドはCBBで染まるような太いバンドと一致していませんか？理想的には、ノックダウンなどでそのバンドが減弱することが確認できると良いのですが。 WBとIPに適用できるとメーカーで保障されている抗体を使っています。また、ストレートのサンプルのWBにおいて同じサイズに検出されています。 しかし、CBBで染まる太いバンドと一致というのは、そうかもしれません。また、確かにストレートのサンプルのWBにおいても、ときに濃くですぎてしまうきらいがあります。抗体のロットによって検出のされ方が違ってしまっているのかな、と考えてはいましたが非特異的なものとは（なぜか）考えていませんでした。 しかし、通常サンプルのWBにおいても、非特異的なタンパクが目的タンパクと同じ位置に同時に検出されてしまっているという可能性も考えられることになりますよね・・・。頭を抱えてしまっています。打開策はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4734-12 - 2016/01/12 (火) 23:12:36 - あqswでfrgthyじゅいこlp； normal IgGも抗体だからね。なかにはサンプル中の蛋白質と反応するものも含まれていることもあるだろうし、ロットによってはそういうのが多いときもあるとおもうので、不思議じゃないとおもう。Pull-downでその蛋白質に対する抗体でウェスタンしたときはどうかな。CBBや銀染色で蛋白質染色したとき両方にあるようにみえても、ウェスタンでは片方だけとかなら、IPはできてるけど、単に運悪く、同じ分子量位置に量の多いコンタミの蛋白質が重なってるだけということでいいとおもうけど。 何と反応するか素性のよく分からないnormal IgGじゃなくてアフィニティ精製されたnon-related antibodyをcontrolで使うことはうちらの仲間内ではよくやる。normal IgGよりは変なことは起こりにくい。

(無題) 削除/引用 No.4734-11 - 2016/01/12 (火) 16:56:11 - 中年 うーん、ご覧になっているバンドは目的タンパク質ではなく、単に量が多いだけの夾雑タンパク質である可能性が否定出来ないように思います。 IPにお使いの抗体は、IPやウエスタンで機能することが確認（もしくはメーカー保証）されているものですか？lysateそのままのストレートのウエスタンで同じサイズにバンドがでますか？そのバンドはCBBで染まるような太いバンドと一致していませんか？理想的には、ノックダウンなどでそのバンドが減弱することが確認できると良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.4734-10 - 2016/01/12 (火) 16:43:59 - AP >免疫動物のnormal IgG を用いているのですが、このサンプルにおいてもそこそこ濃いバンドが検出されてしまいます。 動物ごとに持っているIgのレパートリーが違うので、非免疫個体のIgとはいえ、個体ごとに違うパターンが出ることでしょう。そのバンドパターンをコントロールとして比較してなにか言うというのは無意味じゃないでしょうか。ましてや統計解析でどうにかしようというのは、、、、、統計は適正な実験系で得られたデータでなければ正しい結論を導きません。 免疫動物の同一個体の免疫前血清のIgを使うとか、抗体を免疫原で前吸収したものを使うとかならまだましでしょうけれど。 それよりも、コントロールの非免疫抗体ではバンドが検出されない条件を見つけるのが先決でしょうね。 プレクリアをしていますか（担体に非特異的に吸着するサンプル中のタンパク質あるいは抗体を除くために、リガンドなしの担体を通した上清を使用する） 抗体はアフィニティ精製済みのものですか。あるいは非特異的に吸着する抗体成分を取り除くために適当なタンパク質（サンプルから標的タンパクを欠損／除去したものがあれば理想的だが、BSAでも適当な組織のホモジネートでもいい）で前吸収しておくのも効果がある。

(無題) 削除/引用 No.4734-9 - 2016/01/12 (火) 16:23:50 - som > それではあまり説得力ないと思います。 やはりそうですよね。変な話、何％くらいであれば許容範囲でしょうか。 > サンプルは細胞のlysatesかなんかでしょうか。調製後１６０００gぐらいの遠心で細かい蛋白の塊みたいなものを除く（１６０００gよりは超遠心で１０００００gぐらいのほうがベター）。０.２umのフィルターなどを通す。ビーズへの非特異な吸着なら、サンプルにまずビーズだけをいれてincubateしてビーズを除く（preclearとも言われているようです）。などの処理でまず結果が安定するようなコンディションにする必要がありそうです。アガロースなどのビーズならグリセロールを１０％以上にすると安定することもありますが、磁気ビーズはどうかわかりません。 サンプルは細胞を分画したものを用いています。 細胞質画分に関しては、（必然的に）10,000 g 遠心後のものになりますが、normal IgGでもバンドが検出されてしまっています。 ミトコンドリア-リソソーム（ML）画分に関しては、 > 最初のサンプルの溶液はどんなバッファーですか？ の質問に続くのですが、 サンプル中のタンパク量の1.4倍量になるよう10％SDSをサンプルに添加し、100℃5分加熱後、SDS濃度が0.1％になるようPBSで希釈。このPBS希釈後の9倍量の10*Lysis buffer(界面活性剤はTX-100)を添加し（理論上1*lysis bufferと同じ組成にし）、これをIPに使用しています。 最初の細胞分画はスクロース-EDTAで行っているのですが、これをこのまま使用しますと抗体との反応が見られなかったため(以前こちらで相談させていただきました)、このような処理を施しています。 そのため、ML画分に関しては最初にTX-100等で溶解後、遠心し上清を使うという方法も考えましたが、細胞質画分ではこうした処理は不可能であり、細胞質画分 VS. ML画分を見たい意図もありまして、同じ条件での変性処理を行うかたちをとっています。 > その前に抗体無しでビーズとサンプルを混ぜて、ビーズを回収して、そのビーズから蛋白を溶出してWBしてください。でそこにくっついているなら、ビーズとサンプルを混ぜてビーズを除いたサンプルでやってもいいかもしれませんけど、あなたの蛋白がビーズに純粋に親和性があるのなら、解決方法になっていないでしょう。 ビーズと目的タンパクで親和性があった場合、上清を使っても目的タンパクが無い状態になっている、ということでしょうか。 > PBSTのTはTweenですかTritonですか？濃度はどれくらいですか？ 言葉足らずでした。申し訳ありません。TはTween-20です。濃度は0.1%です。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4734-8 - 2016/01/12 (火) 15:55:04 - som >[Re:5] 中年さんは書きました : > 検出されたバンドが目的タンパク質であることは間違いないのですか？ それを確認しようとnormal IgGを使用したのですが、こうした結果となり果たしてどうなのか、と悩んでおります。翻訳後修飾（アセチル化）の検出を目的としてまして、IP：抗目的タンパク抗体、WB：抗アセチル化リジン抗体　という手段をとっています。確認のためWBでもIP目的タンパク抗体を使っての検出もしていますが、同時に流しているIPをしていないサンプルと同じ分子量の位置にバンドが検出されてはおります。

(無題) 削除/引用 No.4734-7 - 2016/01/12 (火) 14:25:39 - おお >[Re:6] somさんは書きました : > ありがとうございます。 > > 数値化（Image Jを使っています）できたデータで、normal IgGとの差異があるといえるか自分が悩んでいるものでは、normal IgG の濃さが目的タンパクの40％〜50％ほどでした。 それではあまり説得力ないと思います。 察するの実験結果も安定してないようなので、系を改善したほうがいいかと思います。 サンプルは細胞のlysatesかなんかでしょうか。調製後１６０００gぐらいの遠心で細かい蛋白の塊みたいなものを除く（１６０００gよりは超遠心で１０００００gぐらいのほうがベター）。０.２umのフィルターなどを通す。ビーズへの非特異な吸着なら、サンプルにまずビーズだけをいれてincubateしてビーズを除く（preclearとも言われているようです）。などの処理でまず結果が安定するようなコンディションにする必要がありそうです。アガロースなどのビーズならグリセロールを１０％以上にすると安定することもありますが、磁気ビーズはどうかわかりません。 > > ビーズへの非特異的吸着化を確認するには、ビーズには磁気ビーズを使用しておりまして、抗体とビーズを先に結合させてからサンプルを反応させているのですが、ビーズとサンプルで先に反応させて、その上清を別の「抗体-ビーズ複合体」に反応させれば良いのでしょうか。 その前に抗体無しでビーズとサンプルを混ぜて、ビーズを回収して、そのビーズから蛋白を溶出してWBしてください。でそこにくっついているなら、ビーズとサンプルを混ぜてビーズを除いたサンプルでやってもいいかもしれませんけど、あなたの蛋白がビーズに純粋に親和性があるのなら、解決方法になっていないでしょう。 > > washにはPBS-Tを使用しておりますがこの辺はどうでしょうか。 > > よろしくお願いします。 最初のサンプルの溶液はどんなバッファーですか？ PBSTのTはTweenですかTritonですか？濃度はどれくらいですか？ 非特異的な相互作用はデタージェントの種類と濃度で改善する可能性はあります。実際にIPにつかわれるバッファーは様々で、デタージェントはTriton x-100を１％ぐらい入れたものや、更にdeoxycholateを０.１ー０.５％加えたもの、また非常にバックがきれいになる系としてはさらに０.１％SDSを加えたものなどがあります。またそのほかのマイルドなデタージェントを上げるときりがありません。 塩濃度を少し上げることによりイオン相互作用を切ることができますので、抗体などを介した非特異な吸着を防ぐことができる可能性もあります。特にデタージェントセンシティブであまりデタージェントが使えない時はそういう工夫をすることは多いと思います。まあ大抵高くて３００mMNaClぐらいでしょうけどもう少し厳しい洗をするならLiCl３００mMというのもあります。LiClの場合は最後の一洗いで使うことも多いです。

(無題) 削除/引用 No.4734-6 - 2016/01/12 (火) 13:23:06 - som ありがとうございます。 まだ、方法が確立していない部分もあり、数値化できない結果のときもあります。また、IgGで検出されないときもありました。統計的処理に至るまでは回数を重ねることができておりません 数値化（Image Jを使っています）できたデータで、normal IgGとの差異があるといえるか自分が悩んでいるものでは、normal IgG の濃さが目的タンパクの40％〜50％ほどでした。見た目としては、目的タンパクのバンドもその分濃くは出ているものの、normal IgGのバンドも結構くっきりとでているものもあります。 ビーズへの非特異的吸着化を確認するには、ビーズには磁気ビーズを使用しておりまして、抗体とビーズを先に結合させてからサンプルを反応させているのですが、ビーズとサンプルで先に反応させて、その上清を別の「抗体-ビーズ複合体」に反応させれば良いのでしょうか。 washにはPBS-Tを使用しておりますがこの辺はどうでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4734-5 - 2016/01/12 (火) 12:55:31 - 中年 検出されたバンドが目的タンパク質であることは間違いないのですか？

(無題) 削除/引用 No.4734-4 - 2016/01/12 (火) 12:10:53 - おお 非特異のバンドがあまりにもはっきりと出るようだったら系としては信用できないと思った方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.4734-3 - 2016/01/12 (火) 12:09:20 - ttt バンドの定量や統計的処理は可能なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4734-2 - 2016/01/12 (火) 12:08:20 - おお ビーズへの非特異な吸着 normal IgGがたまたまあなたのターゲットと反応してしまった まずはどちらかかみ分けると対処方法を検討しやすいでしょう。

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