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マトリゲルからの細胞分離およびウエスタン用細胞溶解液の作製法 トピック削除
No.4730-TOPIC - 2016/01/10 (日) 00:32:14 - yamcha
マトリゲル上培養した細胞とプラスティックディッシュで培養した細胞の蛋白質発現についてウエスタンブロッティングでの解析を試みております。マトリゲルはコーニング社のものを用いており、細胞分離にも同社製ディスパーゼを用いております。基本的にマニュアルに沿って実施してスフェロイド状になった細胞を回収し、総蛋白質量を揃えてゲルにアプライをしているのですが、インターナルコントロールとして用いてるGAPDHのバンドの濃さが揃わず、試行錯誤しております（遺伝子発現レベルではマトリゲルとプラスティックで差がないことは確認しております）。

バンドの濃さが揃わない原因としては、細胞溶解液中に残存したマトリゲルが存在しているなどあると思われますが、マトリゲルやその他細胞外マトリックスを使って細胞培養のご経験のある方、ウエスタンブロッティングにお詳しい方がいらっしゃいましたら、どのような方法で細胞からゲル成分を除去し、細胞溶解液を作製されているか、また総蛋白質量の代わりにこういう方法でやると良いなどのアドバイス頂けますと幸いです。よろしくお願い致します。
　
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tillUgoqSp 削除/引用
No.4730-9 - 2017/10/23 (月) 05:08:59 - JimmiNi
7UUNfK http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

ありがとうございます。 削除/引用
No.4730-8 - 2016/01/29 (金) 19:40:28 - yamch
おおさん

ありがとうございます。
具体的な解決手段ですね。

DNA定量は細胞溶解液では困難かと勝手に
考えていたのですが、溶解液でも大丈夫なんですね!!!
私の知識不足でした。。。

早速、細胞溶解液からDNAを定量して、
プラスティックとマトリゲル群間でDNA量をそろえて
WBしてみたいと思います。

本当に有難うございます。結果は後日ご報告致します。

WB re-probing 削除/引用
No.4730-7 - 2016/01/28 (木) 03:17:38 - おお
>[Re:6] yamchさんは書きました :
> おおさん

> 2)は、DNA量で補正ということで、これは調べていく中で
> 是非トライしてみたいと思っていました。しかしながら、
> 剥離してきた細胞は概ねスフェロイドを維持していて、
> 通常のcell suspensionのように一部をとって、測定して
> volumeで全体量を算出することが困難のようにも思われます。


cell lysateにした状態で、核のクロマチンが溶出していても、溶出していなくてもいいので（溶出してない場合はよく懸濁して）、一部とってヘキストや DAPIで蛍光を測ればいいです。大抵どんなバッファーでも対応できると思います。

クロマチン（核）が懸濁状態の場合はDNA量測定後遠心で除けばいいでしょう。

アドバイスありがとうございます 削除/引用
No.4730-6 - 2016/01/27 (水) 16:08:28 - yamch
おおさん

たくさんのアドバイスありがとうございます！
おおさんのアドバイスをまとめますと、
1) パーコールなどで密度勾配遠心
2) DNA量で補正
3) Pluronic® F-68 で洗浄

上記三点になりますね。1)は思ってもみない方法でした。
そのようなやり方をされている方がいないか調べてみます。

2)は、DNA量で補正ということで、これは調べていく中で
是非トライしてみたいと思っていました。しかしながら、
剥離してきた細胞は概ねスフェロイドを維持していて、
通常のcell suspensionのように一部をとって、測定して
volumeで全体量を算出することが困難のようにも思われます。

3)のような洗浄液を探しておりました。有難うございます。
また、私自身も以下の洗浄液を最近見つけました。
https://www.trevigen.com/item/239/Cultrex_3D_Culture_Cell_Harvesting_Kit/

まだ、検討を始めたばかりで、流した蛋白を染色してみたこと
ないのですが、やってみたいと思います。引き続き検討してみます。

(無題) 削除/引用
No.4730-5 - 2016/01/13 (水) 16:28:13 - おお
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/24040032
こういうのであらうと解決しないだろうかとふとおもった。

(無題) 削除/引用
No.4730-4 - 2016/01/12 (火) 02:31:42 - おお
ながした蛋白の総蛋白を染色するとどんな感じでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.4730-3 - 2016/01/12 (火) 02:30:07 - おお
総蛋白の代わりということであれば、Lysisの仕方などにもよりますけどDNA量を測って相対的な細胞数とするというのもありえるほうほうかとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.4730-2 - 2016/01/12 (火) 02:25:20 - おお
経験はございませんが、、、
どうするのがよいかなぁと気に留めてましたが、ちょっとアイデアがうかんだといいますか。。。
パーコールなどの媒体で、密度で分離してみたらどうかなぁと。

マトリゲルからの細胞分離およびウエスタン用細胞溶解液の作製法 削除/引用
No.4730-1 - 2016/01/10 (日) 00:32:14 - yamcha
マトリゲル上培養した細胞とプラスティックディッシュで培養した細胞の蛋白質発現についてウエスタンブロッティングでの解析を試みております。マトリゲルはコーニング社のものを用いており、細胞分離にも同社製ディスパーゼを用いております。基本的にマニュアルに沿って実施してスフェロイド状になった細胞を回収し、総蛋白質量を揃えてゲルにアプライをしているのですが、インターナルコントロールとして用いてるGAPDHのバンドの濃さが揃わず、試行錯誤しております（遺伝子発現レベルではマトリゲルとプラスティックで差がないことは確認しております）。

バンドの濃さが揃わない原因としては、細胞溶解液中に残存したマトリゲルが存在しているなどあると思われますが、マトリゲルやその他細胞外マトリックスを使って細胞培養のご経験のある方、ウエスタンブロッティングにお詳しい方がいらっしゃいましたら、どのような方法で細胞からゲル成分を除去し、細胞溶解液を作製されているか、また総蛋白質量の代わりにこういう方法でやると良いなどのアドバイス頂けますと幸いです。よろしくお願い致します。
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