Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（invitrogen)を利用した、組み換えバキュロウイルス作製のため、pFastBac１ベクターを用いて組換えタンパク質発現コンストラクトの作製をおこなっています。
pFastBac1ベクターにCMVプロモータを組み込み、その下流に発現させたいタンパク質の配列を分泌シグナルから終止コドンまで組み込みました。
その後、組み換えタンパクが分泌されるかのチェックのために、作製したコンストラクトをHEK293F細胞にトランスフェクションし、４日間培養後、培養液と細胞を分けて回収した後、ウエスタンブロッティングを行いました。
しかし、細胞を抗原とした場合は、目的のタンパク質のバンドがみられましたが、培養液を抗原とした場合はバンドがみられませんでした。したがって、細胞外に発現させた組換えタンパク質が分泌していないことがわかりました。
分泌が確認できないと次に進めないためトラブルシューティングをおこないましたが、解決ができず困っています。改善策をご提示いただけませんか。
・組み込んだシーケンスは間違っていない
・細胞にははっきりバンドが確認できる
また、pFastBac1べクターを利用している皆様、このベクターで作った発現コンストラクトをHEK293F細胞等に導入して、分泌の確認をしていますか。 |
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