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(無題) 削除/引用 No.4686-22 - 2016/01/20 (水) 18:24:46 - さかな >monさん 回答ありがとうございます。はい。pFastBac1ベクターも精製しています。CAGプロモーターのほうが強力ですが、HEK293F細胞において検出できないレベルではないと思っていました。 >paさん 回答ありがとうございます。ｐFastBac1にCMVｐが挿入された市販のベクターが存在するのですね。わざわざお調べいただきありがとうございます。もっと大きなスケールから濃縮してみます。分泌シグナルはpCAGGSで作成したベクターの配列とコザック配列の関係で1塩基だけかえありますが、同じです。もう一度確認してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4686-21 - 2016/01/20 (水) 16:58:11 - mon paさんの指摘に納得して、思いついたのですが、 HEK293F細胞ではCMV promoterよりCAG promoterの方が数倍強いと思います。 ただ、検出できないレベルではないような。。。 もしかしてpFastBac1ベクターとCAGベクターでplasmidの精製度が異なるとか？pFastBac1ベクターもカラム等で精製していますよね？

(無題) 削除/引用 No.4686-19 - 2016/01/19 (火) 23:54:35 - pa 横からの発言で失礼いたします。 Novagenから売っていたpTriExというベクターはちょうどpFastBacにCMVプロモーターを乗せるような形でしたので、この設計自体は問題なく動くのではないかと思います。また、polyhedrinプロモーターをCMVプロモーターに入れ替えたベクターもBacMamという系で使われる例があるのでこれでも大丈夫そうです。 あさんのご示唆と重なりますが、私も濃縮が不十分である可能性があると思います。細胞内での発現が確認できることから分泌がされてないことを心配されているのだと思いますが、分泌がされている場合でもある程度の量のタンパク質は細胞内に残っていて強く検出されますし、分泌されたタンパク質の培地での濃度は非常に低くなりますので検出にはけっこうな濃縮が必要で、濃縮が不十分で分泌されていない状態と区別できないというのはありうると思います。私の知る例では、はじめ簡単な濃縮では検出できず、思い切って数十mlの培地からIPして1レーンに流すと検出できたということがありました (数字はあいまいです、すみません)。 提案としては出来るだけ大きなスケールで可能ならIPで、まずは検出できるよう極端な条件を試されてはどうかと思います。また、SEAPなど入手が容易な分泌レポーターを利用するなどして、分泌タンパク質のWBでの検出の系があるとトラブルシューティングに有用だと思います。 もう一点、分泌シグナルが問題である可能性も無くはないと思います。現在使われている配列がどの程度の効率で動くのかレポーターで確認するとか、高効率を期待して使われているシグナル配列がいろいろあるので入れ替えて試してみるなど、考慮されてもよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4686-18 - 2016/01/19 (火) 17:38:02 - mon >[Re:17] さかなさんは書きました : > すみません。知識不足なのですが、Polyhedrin promoterを抜くと何に影響がおよぶのでしょうか。 判りません。CMV-cDNA-polyAに問題無いとすると、この領域くらいしか怪しいところがないという消去法です。

(無題) 削除/引用 No.4686-17 - 2016/01/19 (火) 16:43:48 - さかな 回答ありがとうございます。 >[Re:16] monさんは書きました : > cDNAの配列が問題無いとすると、組み込んだCMV promoter-cDNA直前までの配列が問題なのでしょうかね〜？予想外のORFが出来ているとか？Polyhedrin promoterを抜いてみるとか？ すみません。知識不足なのですが、Polyhedrin promoterを抜くと何に影響がおよぶのでしょうか。 > 面倒ですが、CMVpro-cDNA-pAまでを別のベクター(pUCなど）に組み込んで調べるとか（実験のための実験なのでお薦めしませんが）。 かなり行き詰まっているので、そうしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4686-16 - 2016/01/18 (月) 19:35:48 - mon pFastBac1のMapをみましたが、CMV promoterに影響しそうな配列はなさそうですね。 cDNAの配列が問題無いとすると、組み込んだCMV promoter-cDNA直前までの配列が問題なのでしょうかね〜？予想外のORFが出来ているとか？Polyhedrin promoterを抜いてみるとか？ 面倒ですが、CMVpro-cDNA-pAまでを別のベクター(pUCなど）に組み込んで調べるとか（実験のための実験なのでお薦めしませんが）。CMVpromoterではなくEF1alpha promoterに変えてみるとか、CMV promoterとcDNAの間にIntronを挟むとか（これは発現を増強すると思います）。 中途半端な提案で申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.4686-15 - 2016/01/18 (月) 18:58:31 - さかな >[Re:14] monさんは書きました : > >[Re:13] さかなさんは書きました : > > 私の設計した組み換えタンパク質発現のシーケンスをそのまま、pCAGGS等の他のベクターに挿入し、HEK293Fに導入すると何も問題なく、目的タンパク質が分泌されます。 > > それなら、CAG-cDNA-polyAまでをpFastBac１に入れてみたら？ > もとのCMV promoterの3'側配列にinflameのORFがあって余分な配列がくっついているとか、CMV promoterの発現を弱める配列がベクター中に存在するとか？ 返答が遅れてしまい申し訳ございません。回答ありがとうございます。この後の実験に関わる理由があって、どうしてもCMVプロモーターで発現させたいのです…。CMV promoterの発現を弱める配列が、組み込んだ配列の中に存在するかもしれないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4686-14 - 2015/12/27 (日) 11:26:28 - mon >[Re:13] さかなさんは書きました : > 私の設計した組み換えタンパク質発現のシーケンスをそのまま、pCAGGS等の他のベクターに挿入し、HEK293Fに導入すると何も問題なく、目的タンパク質が分泌されます。 それなら、CAG-cDNA-polyAまでをpFastBac１に入れてみたら？ もとのCMV promoterの3'側配列にinflameのORFがあって余分な配列がくっついているとか、CMV promoterの発現を弱める配列がベクター中に存在するとか？

(無題) 削除/引用 No.4686-13 - 2015/12/27 (日) 11:02:10 - さかな 皆様回答ありがとうございます。 >おおさん 私の設計した組み換えタンパク質発現のシーケンスをそのまま、pCAGGS等の他のベクターに挿入し、HEK293Fに導入すると何も問題なく、目的タンパク質が分泌されます。私の作製した組み換えタンパク質が分泌されるものなのか否かのチエックだけをしたかったので、組み換えバキュロウイルス作製の前にpFastBacで作製したプラスミドをHEK293Fに導入したら、分泌されなくて、何がおかしいのかわからず困っています。polyAsiteはSV40polyAシグナルを利用しています。空ベクターを用いたWBのネガコンはとっていませんでした。 >あさん TCA沈殿して濃縮したものではなく、培養液そのまま、あるいは限外ろ過で濃縮したものを用いています。 >preproさん 論文までご丁寧にありがとうございます。少し、実験を進めてみて組み換えウイルスを作製しインフェクション後に、WBを行ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4686-12 - 2015/12/22 (火) 11:43:46 - prepro SV40 polyAが元々あるようですが、同じ系統のDual vectorでCMV-EGFPを293細胞で発現している論文があるので、発現自体は問題ないように思います。 最終的に、baculovirus系で発現させるのなら、動物細胞で発現や分泌を確認しても無駄になることはないでしょうか？ 293F細胞でうまく分泌されたとしても、実際に用いる予定の昆虫細胞で分泌しない可能性もあるわけだし、逆に293F細胞で分泌できていなくても、昆虫細胞でうまくいくかもしれないし。

(無題) 削除/引用 No.4686-11 - 2015/12/22 (火) 09:36:50 - あ 培養液中のタンパク質をTCA沈殿して濃縮したものを用いているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4686-10 - 2015/12/22 (火) 05:38:11 - おお wbでネガコンをとってないならその辺は確かに気になるところですけど、、、 分泌する蛋白の過剰発現はERから分泌にかけてのtransportやprocessingにかかわるシステムに対して飽和した状態になったりすることもあるようで、(実際にそれが原因かすべてにおいて見極めているかわかりませんが)分泌されないということはきく話です。 分泌が得意な細胞に変えるというのは手ですね。CHOはいいみたいですよ(万能とはいえるかわかりませんけど)。 CMVを入れているとのことですが、polyAsiteとかどうしてるんでしょうかね。バキュロのやつを利用してるんでしょうか。どのくらいしっかりきいてるのかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4686-9 - 2015/12/21 (月) 18:03:32 - さかな >[Re:5] monさんは書きました : > さて、pFastBac１ベクターではなく、通常の発現ベクターに組み込んだcDNAでも同様の現象がみられるなら、目的タンパクの性質(foldingしづらいとか）かもしれません。 > 知人から、ある酵素タンパクの一過性発現において、HEK293細胞だと分泌されたが活性がなく、CHO細胞だと問題なく活性がある状態で分泌されたと聞いたことがあります。両細胞間で糖鎖付加の違い（偏り）がありますので、もしかしたら細胞を変えてみるのも手かもしれません。 同じ、哺乳類細胞でも違いが生じるのですね。分泌されるかされないかでも、細胞を変えてみるのも手かもしれませんね。アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4686-8 - 2015/12/21 (月) 17:56:32 - さかな >[Re:7] preproさんは書きました : > >[Re:6] まなさんは書きました : > > これはあかんやつや。 > > > > きちんと原理を理解して、先輩の元で実験すること。 > > > > ほんでもってネガコンを置かない時点で実験として成立してないですから。 > > こんなとこで以降、回答を望むようなことはしないこと。 > > > > 以下、書き込み禁止。 > > なにを偉そうに。 > 質問者が「まんまる」を細胞の形にとらえたのはおもしろかったけど、あなたそもそも質問文理解できてないし、誤解が生じる自分勝手な略称で呼ぶのはどうかと思うよ。ちゃんとmammalianって書きなよ。 哺乳類細胞のことを言っていたのですね。すみません。

(無題) 削除/引用 No.4686-7 - 2015/12/21 (月) 17:21:39 - prepro >[Re:6] まなさんは書きました : > これはあかんやつや。 > > きちんと原理を理解して、先輩の元で実験すること。 > > ほんでもってネガコンを置かない時点で実験として成立してないですから。 > こんなとこで以降、回答を望むようなことはしないこと。 > > 以下、書き込み禁止。 なにを偉そうに。 質問者が「まんまる」を細胞の形にとらえたのはおもしろかったけど、あなたそもそも質問文理解できてないし、誤解が生じる自分勝手な略称で呼ぶのはどうかと思うよ。ちゃんとmammalianって書きなよ。

(無題) 削除/引用 No.4686-6 - 2015/12/21 (月) 17:05:11 - まな これはあかんやつや。 きちんと原理を理解して、先輩の元で実験すること。 ほんでもってネガコンを置かない時点で実験として成立してないですから。 こんなとこで以降、回答を望むようなことはしないこと。 以下、書き込み禁止。

(無題) 削除/引用 No.4686-5 - 2015/12/21 (月) 16:59:13 - mon 動物細胞用の発現ユニットを組み込んだBaculovirusを培地に加えると、細胞内に取り込まれて、発現ユニット内の遺伝子発現が観察出来ます。その前段階で、pFastBac１ベクターで目的遺伝子の発現をcheckしているのしょう。 さて、pFastBac１ベクターではなく、通常の発現ベクターに組み込んだcDNAでも同様の現象がみられるなら、目的タンパクの性質(foldingしづらいとか）かもしれません。 知人から、ある酵素タンパクの一過性発現において、HEK293細胞だと分泌されたが活性がなく、CHO細胞だと問題なく活性がある状態で分泌されたと聞いたことがあります。両細胞間で糖鎖付加の違い（偏り）がありますので、もしかしたら細胞を変えてみるのも手かもしれません。 あるいは、一過性発現だと発現量が多すぎてfoldingが間に合わずmisfoldしたものが溜まっているかも。この場合ならlentivirusなどで細胞内コピー数を減らした安定発現細胞を調製してみるとか。。

(無題) 削除/引用 No.4686-4 - 2015/12/21 (月) 16:22:34 - さかな 皆様ご回答ありがとうございます。ちなみに、私はバキュロウイルス発現系を初心者です。説明足らずな点があり申し訳ございません。 >[Re:3] preproさんは書きました : > CMVを入れていると書いてますよ。 > なぜわざわざこのベクターを使うのかは謎ですけど、発現はするんじゃないですかね。 最終的にはBacミドを作製しますが、DH10Bacにトランスフォーメーションする前に、発現するタンパク質が分泌されるかを確認したいと考え、HEK293Fにトランスフェクションし、タンパク質分泌の確認を行おうとしています。 > > その目的のタンパク質は本当に分泌型ですか？ > 膜結合型として発現してから、切断されて分泌型になるわけではないですか？ 分泌型です…。 >[Re:2] まなさんは書きました : > pFASTBac1ってまんまるの細胞でも発現するんでしたっけ？これってDH10バックという大腸菌用のプラスミドじゃなかった？ まんまるの細胞というのは、細胞の形のことでしょうか。Bacミド作製用のプラスミドをトランスフェクションしてもタンパク質は分泌されないのでしょうか。 > > こいつを293に発現させて出てくるバンドは本物？エンプティーベクター入れた奴ではバンドでてないのかな？ 空ベクターのトランスフェクションは行っていません…。

(無題) 削除/引用 No.4686-3 - 2015/12/21 (月) 10:57:36 - prepro >[Re:2] まなさんは書きました : > pFASTBac1ってまんまるの細胞でも発現するんでしたっけ？これってDH10バックという大腸菌用のプラスミドじゃなかった？ > > こいつを293に発現させて出てくるバンドは本物？エンプティーベクター入れた奴ではバンドでてないのかな？ > > だってこのプラスミドってバックミド作るようじゃないのかね？ CMVを入れていると書いてますよ。 なぜわざわざこのベクターを使うのかは謎ですけど、発現はするんじゃないですかね。 その目的のタンパク質は本当に分泌型ですか？ 膜結合型として発現してから、切断されて分泌型になるわけではないですか？

(無題) 削除/引用 No.4686-2 - 2015/12/21 (月) 10:10:49 - まな pFASTBac1ってまんまるの細胞でも発現するんでしたっけ？これってDH10バックという大腸菌用のプラスミドじゃなかった？ こいつを293に発現させて出てくるバンドは本物？エンプティーベクター入れた奴ではバンドでてないのかな？ だってこのプラスミドってバックミド作るようじゃないのかね？

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