Bio Technical フォーラム

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ゲル抽→TAクローニング トピック削除
No.4677-TOPIC - 2015/12/17 (木) 19:50:14 - yjm
マウスゲノムをCRISPR/Cas9で切断後にloxPのノックインを試みており
ジェノタイピングを行う際にWTバンドよりも大きいバンドのDNAをゲルから抽出し、TAクローニングを行いEcoRI処理でインサートの確認を行ったところ
目的とする長さのバンドをインサートに持つものとWTと同じ長さのインサートを持つものの2種類が得られたのですが
原因がわかる方はいらっしゃいますか？
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4677-3 - 2015/12/17 (木) 22:14:52 - 中年
APさんの仰るとおりなのですが、プラスミドを切断したバンドの切り出しでも、大きい断片には小さな断片がコンタミして来ます。再泳動するとばっちりバンドが見えたりするくらいに。私たちの眼はグラデーションの中にエッジを無理やり検出してしまう特性があるので、２本のバンドはきっちり分離しているように見えますが、ゲルパターンをカメラで取り込んでバンドの輝度でカーブを書いたりすると、短いバンドのテールがしっかり大きいバンドまで届いていることが見えて驚いたりします。

(無題) 削除/引用
No.4677-2 - 2015/12/17 (木) 19:58:00 - AP
えっ、単なるコンタミじゃないの。
長い方を切り出したといっても完全にWTが排除できているとは限らないでしょう。特にWTのほうが先に流れるので、通ったあとのアガロースに吸着して残ったりテーリングして長いバンドにかぶったり、バッファーを媒介に混入したり目に見えなくても起こっているはずですよ。

ノックイン出来た方のDNAは長さがより長いことや配列の特性（反復配列など）で形質転換効率がWTのものより低くて、コンタミのほうもある程度高い頻度を占めていたのかもしれない。

ゲル抽→TAクローニング 削除/引用
No.4677-1 - 2015/12/17 (木) 19:50:14 - yjm
マウスゲノムをCRISPR/Cas9で切断後にloxPのノックインを試みており
ジェノタイピングを行う際にWTバンドよりも大きいバンドのDNAをゲルから抽出し、TAクローニングを行いEcoRI処理でインサートの確認を行ったところ
目的とする長さのバンドをインサートに持つものとWTと同じ長さのインサートを持つものの2種類が得られたのですが
原因がわかる方はいらっしゃいますか？
よろしくお願いいたします。
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