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(無題) 削除/引用 No.4670-8 - 2015/12/20 (日) 01:46:54 - mikio aiuさん、ご意見をありがとうございます。 PFA固定の前（live neuron)・後の両者で１次抗体をincubateしてみたのですがいずれでも染まらず、低濃度短時間のTriton X処理後やウエスタンブロットでは染まるという結果の解釈について、抗体のエピトープが元来何らかのマスクを受けた状態であり、抗体がアプライされにくい可能性を考えました。 おおさんも書かれているproteinase Kによる抗原賦活（IHCでなく、DNA抽出に使用する程度のマイルドなもの？）については、実はメーカーからもそれとなくsuggestionがあり研究室内でも協議したのですが、細胞膜のKチャネルそのものに影響を与える可能性があり、仮に染色されても定量性に欠けるとの理由で見送られたという経緯があります。 今回は染色後に定量的評価を検討していますので、膜蛋白をなるべく傷つけないような前処理について検討していければと考えておりまして、もしさらにアドバイスをいただけましたらありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.4670-7 - 2015/12/18 (金) 14:29:12 - aiu 固定はPFA？だとしたら抗原賦活化とかしてみたらどうだろう？

(無題) 削除/引用 No.4670-6 - 2015/12/17 (木) 17:06:22 - mikio おおさん、丁寧にお返事くださりありがとうございます。 培養細胞への影響も考慮しながら、お示しいただいたようなDDTの低濃度から少し条件を振りつつ、試してみたいと思います。 また検討した結果などが出ましたら、この場に投稿させていただくことがあると思いますが、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4670-5 - 2015/12/17 (木) 06:00:04 - おお 水溶液中ではDTTは意外と不安定です。特に酸性領域では。0.5-1M のストックを小分けして-20度で保存しておきPBS溶液に加えるのは用事調製にするといいかと思います。抗体もS-S結合を持ってますので(抗体は還元剤に強いといわれてますが)程度によっては活性が落ちるかもしれません。なのでPBSなどに1~10mMほど加えて5分間ほどincubateして一度洗ってから抗体を加えるといいかと思います(10mMは個人的な感覚ではかなり高いとは思います. 細胞の調子がどの様になるかよくわかりませんのでそれもあわせて条件検討がいるかもしれません。)。抗体と共存ということでしたら0.2mMぐらいでしょうかねぇ。。。 DTTの代わりに2-MEを使うのもありかとおもいます。この場合は原液から用事調製でいいでしょう。ただし還元力が弱いので、DTTの10倍ほどの濃度が必要になってくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4670-4 - 2015/12/17 (木) 03:53:57 - mikio ナナシさん、おおさん、早速ご意見をいただきありがとうございます。 当方の研究室内の試薬に目を通しましたところ、私はSDS-PAGEでも使用経験がないのですが、DTT粉末があり、まずは還元剤としてICCで試してみたいと考えています。 ICCで還元剤として使用する場合のDTTの調整濃度・反応させる時間・ほか注意点などについて（そんなことわからないというのがごもっともなご意見とは思いますが・・）、SDS-PAGEなどで使用経験のある方々から何かご意見をいただけましたら幸いです。 またICCではバッファーとしてはPBS 1×（PH7.4前後)を通常使用していますが、pHやPBS中での活性維持なども問題になりますでしょうか（調べたところによれば、pH7.4はDTTの反応に問題ないような記載を見つけられました）？

(無題) 削除/引用 No.4670-3 - 2015/12/16 (水) 19:53:44 - おお 適当な想像ですが非常にマイルドなプロテアーゼ処理とか、抗体にさらす前にDTTなどの還元剤で処理するとか。

(無題) 削除/引用 No.4670-2 - 2015/12/16 (水) 19:36:26 - ナナシ 細胞表面の他の分子（タンパク・糖鎖・糖脂質）などがエピトープをマスクしてる可能性は？ その場合は低濃度のグアニジンとかでも乖離可能な気もする。膜もある程度損傷されるだろうけど。 イオン強度やpHを変えても場合によってはいけるだろうか？

細胞膜貫通イオンチャネル標識時のエピトープについて 削除/引用 No.4670-1 - 2015/12/16 (水) 18:57:55 - mikio 初めて質問させていただきます。ご意見をいただきたくお願い申し上げます。 　この度、培養神経細胞の細胞膜の膜貫通カリウムチャネルをコマーシャル抗体で標識（ICC/Fr)すべく、モノクローナル抗体を購入しました。 　このカリウムチャネルは生理的状況下でエンドサイトーシス機構で細胞表面から細胞質内を循環していることが知られております。 　そこで今回は細胞膜表面に発現している分画のみをICCで検出したいため、モノクローナル抗体のエピトープのsynthetic peptideがチャネルの細胞外ドメイン配列（10アミノ酸配列以上）に対応しているものを選び、Triton xなどによる膜透過をおこなわないで（つまり、細胞質内分画を染めないで）、細胞膜表面に発現しているもののみを標識したいと考えています。 　文献で同じ抗体を使ったICCが散見できるのですが、メソッドでは調べた限り、全て0.1%tritonやtween20の前処理が行われており、膜透過しないで抗体が反応するか不安であったため、事前にメーカーに問い合わせましたが大丈夫だろうとの返事でした。 　しかし、実際にはTritonX処理なしでは染まらず、処理後のものでは表面と細胞内の両者に対応したシグナルが確認できました。実際にメーカーのサポートに写真などを送って見せて事情を説明したところ、有効な改善法がなく返品に応じるとのことでしたが、代替の抗体が見つからず、このままでは手法そのものを変更しないといけない状況です。 　そこで、質問なのですが、膜貫通蛋白でエピトープが細胞外ドメインに対応した部分のモノクローナル抗体であるのに、界面活性剤を使わないと染まらないというのは、単純にTritonxなどで界面活性剤としての膜透過作用が必要なのか、他の作用が目的なのかどう考えたらよろしいのでしょうか？ 　また、膜透過以外の作用を考える場合に、界面活性剤以外（膜透過作用のない）で代用できる可能性があるものがありましたら、教えていただけましたら幸いです。 　長々と失礼いたしましたが、ご意見いただきたく何卒よろしくお願い申し上げます。

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