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(無題) 削除/引用 No.4668-7 - 2015/12/16 (水) 17:30:34 - 大学院生です cc様、アドバイス下さり、有り難うございます。 ＞siRNAでもshRNAでも、ターゲットの基底状態の発現が低い場合はノックダウンの効果は見かけ上低くなり、あまり差が見られなくなることは多いです。 以前、蛋白質Xの発現が多い細胞株で、shRNA（一過性）によるノックダウンをしてみた事があったのですが、それはそれでmockとの差が少なく、「焼け石に水」状態なのかと考え、蛋白質の発現が少ない細胞株で行っていました。 ＞最近はやりのCRISPR/Cas9でノックアウトの方がよいかもしれません。 少し敷居が高い気持ちが致しますが、それも視野に入れて検討させて頂きたいと存じます。 ＞RT-PCRで注意しないといけないのは、プライマーの設計部位です。 ＞ただし、設計したsiRNAが翻訳阻害を行っているだけなら、PCRでは解析できないでしょう。 有り難うございます。今までshRNAについてもやっとした理解しかしていませんでしたが、今回皆様のアドバイスを頂き、また自分なりに考え調べてみて、少し理解が進んだように思われます。 有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.4668-6 - 2015/12/16 (水) 16:54:30 - CC siRNAでもshRNAでも、ターゲットの基底状態の発現が低い場合はノックダウンの効果は見かけ上低くなり、あまり差が見られなくなることは多いです。 今回の細胞での発現がWestern Blottingで検出できない程度であるなら、条件を工夫して検出できたとしても差を見るのは難しい気がします。 最近はやりのCRISPR/Cas9でノックアウトの方がよいかもしれません。 RT-PCRで注意しないといけないのは、プライマーの設計部位です。 Dicerによる切断後にmRNAは分解されていくのですが、切断部位から遠いところにプライマーを設計すると分解が進んでいない配列が増えてしまう可能性があるので、切断部位近傍に設計した方がよいとされています。挟む必要はないですが、近い方がよいと思います。 また、逆転写にはrandom hexamerではなくoligo dTを使用して、切断部位の上流（5'側）にPCR用のプライマーを設計すると、切断されたmRNAは逆転写されないので、より正確に解析できます。 ただし、設計したsiRNAが翻訳阻害を行っているだけなら、PCRでは解析できないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4668-5 - 2015/12/16 (水) 16:30:50 - 大学院生です 大学院生です。 おお様、アドバイス下さり、有り難うございます。 ＞ちなみに細胞株の名前とか開示できますか？そうであれば経験ある人からのコメントがつきやすいかもしれません。 論文で出ていた細胞はHT-29という結腸腺癌由来の細胞です。自分がみたいのは、脳腫瘍（グリオーマ）系の細胞で、YKG1とかU87MG等です。 皆様からのアドバイスを引き続きお待ち申し上げます。 宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4668-4 - 2015/12/16 (水) 15:09:14 - おお 細胞の （由来組織その他）での効果のバリエーションは経験のある人の意見も待ってみると言いでしょう。ちなみに細胞株の名前とか開示できますか？そうであれば経験ある人からのコメントがつきやすいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4668-3 - 2015/12/16 (水) 14:32:26 - 大学院生です おお様、いつも有り難うございます。 ＞マウスとヒトでプロモーターの相性もあったような、、、ただそれ以外は非常に強いプロモーターを使っているので組織によってこのプロモーターという選択はあまりされていないと思います。 論文ではヒト由来の細胞株を使用されており、自分が使用しているのもヒト由来の細胞株です。ですので、細胞株の問題ではなさそうという事ですね。 ＞WBで下がっていれば、その蛋白の機能を抑制できているのでそれが目的であればそれでいいです。mRNAを見る必要もありません。 元々蛋白質Xは、調べたい細胞株内での発現量が少ない為、WBで検出する事を少し難しく（再現性のある綺麗な結果を出すのが難しいと）感じており、mRNAレベルで証明できたら良いな〜等と考えておりました。しかし、ここは手を抜いて良いところではないので、今から全力でWBによる評価に取り組みます。

(無題) 削除/引用 No.4668-2 - 2015/12/16 (水) 13:54:08 - おお >[Re:1] 大学院生ですさんは書きました : > > １）現在使用しているベクターは、現在使用している細胞とは異なる臓器由来の細胞株において抑制効果が認められた、と論文に記載されているものです。 > 細胞株によってノックダウン効果に違いが生じるのでしょうか？その場合の原因はどこにあると考えるべきでしょうか？ マウスとヒトでプロモーターの相性もあったような、、、ただそれ以外は非常に強いプロモーターを使っているので組織によってこのプロモーターという選択はあまりされていないと思います。 > > ２）過去の関連トピを見た時、「リアルタイムで評価に差がなくても、翻訳阻害をしているのかもしれないので、WBで評価すべき」との内容がみられました。逆に考えると、WBでノックダウン効果を示す事ができれば、リアルタイムでのノックダウン効果を呈示出来なくても、次のステップに進んで良いのでしょうか？ WBで下がっていれば、その蛋白の機能を抑制できているのでそれが目的であればそれでいいです。mRNAを見る必要もありません。 > > ３）ノックダウン効果をリアルタイムPCRで確認する時には、shRNAあるいはsiRNA標的配列を挟んだプライマーを使用しなくてはならないのでしょうか？ その必要は感じません。

shRNAについて教えて下さい 削除/引用 No.4668-1 - 2015/12/16 (水) 13:11:32 - 大学院生です 大学院生です。 shRNAで、特定の遺伝子をノックダウンする事で、その機能を解析したいと考えています。 所属講座にshRNA用のベクターがあったのですが、ノックダウン（一過性発現&レトロウィルスでのトランスフェクション）した細胞をリアルタイムPCRで評価しても、殆ど有意差がみられません。 当初トランスフェクション効率が悪いのかと考え色々工夫しましたが、目安となるGFPは８割以上光っていても、芳しい結果がでません。 shRNAのターゲットとなる配列が悪いのではないかと考え、今後市販のsiRNAや、自分で新たなshRNAベクターを作成しようかと考えておりますが、その前にいくつか質問をさせて頂きたく、トピを立てました。 質問は以下の点です。 １）現在使用しているベクターは、現在使用している細胞とは異なる臓器由来の細胞株において抑制効果が認められた、と論文に記載されているものです。 細胞株によってノックダウン効果に違いが生じるのでしょうか？その場合の原因はどこにあると考えるべきでしょうか？ ２）過去の関連トピを見た時、「リアルタイムで評価に差がなくても、翻訳阻害をしているのかもしれないので、WBで評価すべき」との内容がみられました。逆に考えると、WBでノックダウン効果を示す事ができれば、リアルタイムでのノックダウン効果を呈示出来なくても、次のステップに進んで良いのでしょうか？ ３）ノックダウン効果をリアルタイムPCRで確認する時には、shRNAあるいはsiRNA標的配列を挟んだプライマーを使用しなくてはならないのでしょうか？ 何卒宜しくご教示の程お願い申し上げます。

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