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(無題) 削除/引用 No.4664-15 - 2015/12/23 (水) 07:05:01 - しろ >[Re:10] 初心者さんは書きました : > おお様 > > > おなじ酵素を使いましたか？ > > qPCR用の酵素を使って行いましたので、違う酵素を使いました。cDNAは同じものを使いました。 > >[Re:9] 初心者さんは書きました : > しろ様 > > ということはやはりリアルタイムPCRの機械に問題が発生したのではないでしょうか。別の方に一度リアルタイムを使ってもらったらどうでしょう。その方の結果がよければ初心者さん側に、同じようなトラブルが見られれば機器あるいは設定に問題があるかわかりますよね。 > > 他の人に使ってみてもらったところちゃんと増幅は見えていましたし、Roxのぶれもありませんでしたので、私の方に原因があるのではないかと思っています。 だいぶ原因が絞れてきたのではないのでしょうか。増幅が見えた方と初心者さんが使っている酵素は違うものですか？同じであれば初心者さんの手技に、違えば使用しているものに原因があるのでは。

(無題) 削除/引用 No.4664-14 - 2015/12/23 (水) 04:52:02 - おお >[Re:10] 初心者さんは書きました : > おお様 > > > おなじ酵素を使いましたか？反応系で何が同じで何が違うかは常に意識しないといけないので。できれば全く同じ反応系で通常PCRを走らせるといいのですが何をやったのかこちらからでは見当がつきませんので。 > > qPCR用の酵素を使って行いましたので、違う酵素を使いました。cDNAは同じものを使いました。 > これから言えることはなんですか。またこれで確認できないことはなんですか。同じ酵素を使うという発想はでてきませんか? > はじめはネガティブコントロールを同時にまわしていなかったものでcDNAのせいでROXのぶれが起こっているのかと思ったので、そうでないことを確認したためです。 何を疑ってたのかいまいち明瞭ではないですが、、、

(無題) 削除/引用 No.4664-13 - 2015/12/22 (火) 15:50:40 - tana > ROXのぶれ 縦軸のスケールが違っているだけかと

(無題) 削除/引用 No.4664-12 - 2015/12/22 (火) 15:29:53 - おお >他の人に使ってみてもらったところちゃんと増幅は見えていましたし、Roxのぶれもありませんでしたので、私の方に原因があるのではないかと思っています。。 その人とどこが違うのかを検証していけばいいじゃないですか。一度その人にあなたがやっているところを見てもらって間違ったことをしているとか、そういうのがないか見てもらったらどうですか。

(無題) 削除/引用 No.4664-11 - 2015/12/22 (火) 15:19:57 - おお ROXのぶれって言ったどういうことがおこっているんですか。

(無題) 削除/引用 No.4664-10 - 2015/12/22 (火) 14:56:29 - 初心者 おお様 > おなじ酵素を使いましたか？反応系で何が同じで何が違うかは常に意識しないといけないので。できれば全く同じ反応系で通常PCRを走らせるといいのですが何をやったのかこちらからでは見当がつきませんので。 qPCR用の酵素を使って行いましたので、違う酵素を使いました。cDNAは同じものを使いました。 > どんな状況かはっきりしませんけど。。。ROXはネガティブコントロールでもテストしているサンプルでもポジティブコントロールでも振る舞いは一緒のはずですよね（実験誤差による値の違い以外は）。ネガティブコントロールで違うことを期待しているんですか。 はじめはネガティブコントロールを同時にまわしていなかったものでcDNAのせいでROXのぶれが起こっているのかと思ったので、そうでないことを確認したためです。 > 機械名が開示できればそれぞれのアウトプットなどの数字とか他の人の数字と比較できるかもしれませんけど、いかがなもんでしょうかねぇ。 機械はStep Oneを使っています。

(無題) 削除/引用 No.4664-9 - 2015/12/22 (火) 14:51:17 - 初心者 しろ様 > ということはやはりリアルタイムPCRの機械に問題が発生したのではないでしょうか。別の方に一度リアルタイムを使ってもらったらどうでしょう。その方の結果がよければ初心者さん側に、同じようなトラブルが見られれば機器あるいは設定に問題があるかわかりますよね。 他の人に使ってみてもらったところちゃんと増幅は見えていましたし、Roxのぶれもありませんでしたので、私の方に原因があるのではないかと思っています。。

(無題) 削除/引用 No.4664-8 - 2015/12/19 (土) 12:35:54 - おお >[Re:6] 初心者さんは書きました : > 通常のPCRを行ったところ、増幅は見られましたのでテンプレート、プライマーには問題はないと考えています。 おなじ酵素を使いましたか？反応系で何が同じで何が違うかは常に意識しないといけないので。できれば全く同じ反応系で通常PCRを走らせるといいのですが何をやったのかこちらからでは見当がつきませんので。 > 過去失敗したデータを見たところネガティブコントロールでもROXの蛍光の乱れが見られました。 どんな状況かはっきりしませんけど。。。ROXはネガティブコントロールでもテストしているサンプルでもポジティブコントロールでも振る舞いは一緒のはずですよね（実験誤差による値の違い以外は）。ネガティブコントロールで違うことを期待しているんですか。 機械名が開示できればそれぞれのアウトプットなどの数字とか他の人の数字と比較できるかもしれませんけど、いかがなもんでしょうかねぇ。 > SYBER greenも複数使ってみましたがかわりありませんでした。 > なにが原因かわからず困っています。

(無題) 削除/引用 No.4664-7 - 2015/12/19 (土) 11:22:17 - しろ >[Re:6] 初心者さんは書きました : > 通常のPCRを行ったところ、増幅は見られましたのでテンプレート、プライマーには問題はないと考えています。 > 過去失敗したデータを見たところネガティブコントロールでもROXの蛍光の乱れが見られました。このことからもテンプレートが原因ではないように思います。 > SYBER greenも複数使ってみましたがかわりありませんでした。 > なにが原因かわからず困っています。 >[Re:4] 初心者さんは書きました : > > 失敗しましたがPCR後に電気泳動して増幅しているかチェックしてみたところ増幅していませんでした。 > リアルタイムを始めて最初の一回か二回は成功したことがあるのですが、そのとき用いたのと同じテンプレートとプライマーを用いているので問題はないと思います。マシーンは最近購入したものですし、設定も変えていません。 ということはやはりリアルタイムPCRの機械に問題が発生したのではないでしょうか。別の方に一度リアルタイムを使ってもらったらどうでしょう。その方の結果がよければ初心者さん側に、同じようなトラブルが見られれば機器あるいは設定に問題があるかわかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.4664-6 - 2015/12/19 (土) 10:32:11 - 初心者 通常のPCRを行ったところ、増幅は見られましたのでテンプレート、プライマーには問題はないと考えています。 過去失敗したデータを見たところネガティブコントロールでもROXの蛍光の乱れが見られました。このことからもテンプレートが原因ではないように思います。 SYBER greenも複数使ってみましたがかわりありませんでした。 なにが原因かわからず困っています。

(無題) 削除/引用 No.4664-5 - 2015/12/16 (水) 10:21:15 - おお まずはプライマーとテンプレートで通常のpcrマシーンで増やしてみれば?

(無題) 削除/引用 No.4664-4 - 2015/12/16 (水) 10:16:23 - 初心者 おお様 > チェックする点がいくらかあるのだから、そういうので一つ一つ確認しながらどこが悪いか探るといのが、どういう上級者でもやることです。PCR後電気泳動などして増幅を確かめましたか。増幅てないならテンプレートが問題ですか、プライマーが問題ですか、酵素が問題ですか、それともマシーンや設定の問題ですか？などなど、理屈で考えればたどり着けることばかりですよ。 > > 最低限何をチェックして、どうだったのかなど情報がないと導きようがありません。 失敗しましたがPCR後に電気泳動して増幅しているかチェックしてみたところ増幅していませんでした。 リアルタイムを始めて最初の一回か二回は成功したことがあるのですが、そのとき用いたのと同じテンプレートとプライマーを用いているので問題はないと思います。マシーンは最近購入したものですし、設定も変えていません。

(無題) 削除/引用 No.4664-3 - 2015/12/15 (火) 15:56:34 - 774 身近で上手な人を捜して直接アドバイスもらうのが一番かと。

(無題) 削除/引用 No.4664-2 - 2015/12/15 (火) 15:55:27 - おお チェックする点がいくらかあるのだから、そういうので一つ一つ確認しながらどこが悪いか探るといのが、どういう上級者でもやることです。PCR後電気泳動などして増幅を確かめましたか。増幅てないならテンプレートが問題ですか、プライマーが問題ですか、酵素が問題ですか、それともマシーンや設定の問題ですか？などなど、理屈で考えればたどり着けることばかりですよ。 最低限何をチェックして、どうだったのかなど情報がないと導きようがありません。

リアルタイムPCRの失敗 削除/引用 No.4664-1 - 2015/12/15 (火) 15:39:14 - 初心者 リアルタイムPCRを始めたのですが、増幅が得られません。 ROX色素も一定値をとっていません。 初心者なので全く手技に自信もなく困っています。経験のあるかた、詳しい方はコツや気をつける点などぜひご教授お願いします。

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