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(無題) 削除/引用 No.4660-5 - 2015/12/14 (月) 08:56:15 - 独り言 でも実際にHelaとか293でCRISPRでノックアウトしている論文はかなりあると思うので、普通にできますよ。

(無題) 削除/引用 No.4660-4 - 2015/12/14 (月) 06:40:39 - おお 心配はわかるのですが、HeLaとかこの実験系のモデルとしてもよく使われていませんか? Transfectionの効率や発現量もクリティカルかもしれませんので、2倍体の細胞をつかっても発現が反応の閾値を超えない、超える頻度が低いようでは結局使えないか、労力がいるのかもとも思います。 HeLaに限らず癌細胞や不死化細胞などてCRISPR-Cas9システムはよく使われていると思いますが、そう言う細胞は染色体はすでにぐちゃぐちゃです。 PCRしてクローニング後配列を読むのは簡易なシステムが出来上がっていたらそんなに苦労はないと思いますが、あまりそう言うことをしないラボでは荒技と感じることもあるのかもしれません。この辺はmolecular cloningを得意とするラボに相談してみるといいかもです。 PCRでサイズを見るのも非常にうまくやれば1ベースの違いを見分けられます。それでintactがある可能性が否定できるとはおもいます。 もうちょっと工夫をするならPAMから3ベース上流をきるんでしたっけ。そこに制限酵素認識配列がある場所をターゲットにすれば、PCR後、そのまま、制限酵素処理したものを流せば、そこがつぶれているか検討がつくと思います。 single cloneを拾うことによる弊害は確かにありますが、それは安定導入株でもよくやられることなので、皆さんそれを理解した上でやっていると思いますがいかがなもんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4660-3 - 2015/12/13 (日) 23:52:19 - KKI 同じ様な実験をしています。 変異はどのように検出する予定でしょうか？ Westernで確認することは可能かもしれませんが、シークエンス解析は困難かもしれません。 二倍体の両方に変異を入れる際は、波形データが見づらくなる程度でどのような変異が起こっているのかは分かるとは思います。CodonCodeという有料ソフトが便利だった気がします（フリートライアルで30日だけ使えます）。 染色体構造が乱れていたり、多倍体化している場合はシークエンス解析のデータがどの程度信頼出来るかわかりません。 PCR産物をクローニングして、それをシークエンス解析するという荒業もありますが、かなりの労力が必要なのでおすすめはしません。 またノックアウトが成功した細胞が出来た場合でも、それぞれの細胞が違う染色体構造を持つがゆえにバラつきがかなり出てしまう可能性があります。 細胞が得られたあとはどのような実験を計画しているのでしょうか？ 場合によってはN数がかなり必要になる可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.4660-2 - 2015/12/13 (日) 18:42:02 - AP がん細胞でなくても、そもそも培養細胞なんてのは核型がめちゃくちゃになってるのがほとんどじゃないですか。部分的な多倍数性とか。 他倍数性でも、ある程度の長期間、薬剤耐性マーカーなどでCRISPR/Cas9系を持たせると（そんなめちゃくちゃ長くでなくてせいぜい数パッセージ）全標的をヒットしたものはそれほど難しくなくとれるみたいです。 二重鎖切断（DSB)のかなりのフラクションは、相同染色体あるいは姉妹染色体との相同組換え修復（HR)で修復されると考えられます。だから実際にはCRISPRによる切断は突然変異として観察されるより頻度はずっと高いと考えられます。突然変異体の出現頻度があまり高くない、なかなかとれないというのはそういう理由もあると思います。 4倍体を考えてみましょうか。 相同染色体が４本もあると一本やられてもHRのチャンスが高くなって変異は生じにくいでしょう。しかし、一度、変異が起これば、変異によってその染色体はCRISPRの標的になりませんから標的は３つに減ります。同時にHRで野生型にもどる確率が少し減るとともに、第一の変異染色体を鋳型にHRが起こり、野生型→第一の変異への遺伝子転換が起こるチャンスも生まれます。DSBの大部分がHRで修復されることから、それはかなりの見込みがあります。 そういうことが繰り返されれば、先に出来た変異のコピーにしても新規に生じたものにせよ、いずれすべての相同染色体に突然変異が行き渡るでしょう。 肝心なのは野生型→変異型の一方通行で逆行はしないこと。変異が入ればCRISPRは効かなくなりますので。

染色体構成が乱れている細胞でのゲノム編集について 削除/引用 No.4660-1 - 2015/12/13 (日) 15:09:16 - Hina こんにちは。これからCRISPR-Cas9システムを利用して遺伝子のノックアウトを行う予定でいます。理解としては両アリルがフレームシフトになったシングルクローンを取得することがゴールだと思っています。 ただし、これから私が行おうとしているのはHeLa S3などのガン細胞株です。 これらのガン細胞では染色体の構成が乱れている可能性が高いと思います。たとえばトリソミーなどといった具合にです。 そうなると遺伝子のノックアウトの取得は難しくなるのでしょうか？ たとえば正常細胞では父と母の両アレルを同時に潰せればOKで、ですがガン細胞ではある遺伝子が２つのアレル以外にもっとあったりしたら・・と考えると、私はこれから取り掛かってもいいのか不安に感じています。アドバイスやコメントをいただけると大変嬉しいです。よろしくお願いします。

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