BioTechnicalフォーラム [リン酸化シグナルの反応停止剤について教えてください]

リン酸化シグナルの反応停止剤について教えてください

No.4650-TOPIC - 2015/12/10 (木) 12:42:06 - SA

現在、細胞内のリン酸化シグナルの研究を行っているものです。

細胞へある種の刺激を加えた後のリン酸化シグナルカスケードについて実験しようと思っているのですが、刺激後のリン酸化停止剤でいいものがないか、調べているところです。

皆様の中で、シグナルカスケード研究を行っている方やリン酸化シグナル停止剤でいい試薬を知っている方がいらしたら、ぜひ、ご教授ください。

さきほどのトピックで血小板シグナルについて質問しているものがありますが、それが私が行っている実験のバックグランドになります。同じようなトピックになってしまっていますが、失念いたしました。

以上、よろしくお願いいたします。
　

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No.4650-8 - 2015/12/12 (土) 06:49:22 - protein

Phospho-Flowができるなら浮遊した状態からPFAで一気に固定するので遠心とかWashとかの影響を考えなくていいので良いかもしれないです。

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No.4650-7 - 2015/12/11 (金) 09:06:11 - Loach

血小板のシグナル解析をしていますが、洗浄血小板を刺激後直接LysisしてIPなりWBをしています。
たまさんも書かれていますが血小板は低温になっただけで活性化しますし、インヒビターを添加せず他の一般的な細胞を扱うように遠心してペレットにしただけでも活性化・凝集してしまったりします。今の季節ですと気温も低いので、遠心機の温度にも注意しなければならないと思います。また、個人の手技の違いによっても精製した血小板の活性化の状態がかなり変わります。
もう一つのトピックを見ますと刺激後に遠心・撹拌が入るようですが、どういう実験デザインなのか開示できる範囲で詳細が知りたい所ですね。

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No.4650-6 - 2015/12/10 (木) 21:34:23 - 独り言

浮遊細胞なんですね。

経験ないですけど、低温にしたらほとんどの反応はほぼ止まると思うので、氷水（塩分でも含ませた）にどっぷりいれて、すばやく4度まで落としてからその後の操作をすればいいかも。

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No.4650-5 - 2015/12/10 (木) 16:50:52 - おお

実はバックグランドレベルのリン酸化を見ているとか無いでしょうか？そのカスケードが活性化しているかみるには活性化していない状態のコントロールがあるのが理想的じゃないかと思いますけど。

その細胞へのtransfectionが可能ならKDとかドミナントネガティブの発現ベクター導入とか、、、ターゲットのKinaseの特異的な阻害剤があるならそれを加えてもいいかと。

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No.4650-4 - 2015/12/10 (木) 14:36:34 - mon

タンパク相互作用をみる必要が無いのでしたら、冷アセトン固定とか、TCAとかSDSサンプルバッファーで全タンパクを変性させるとか？？
細胞抽出液内のATPを枯渇させるなら、Apyrase。
的外れなら申し訳ない。

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No.4650-3 - 2015/12/10 (木) 13:46:02 - たま

血小板の凝集によるリン酸化反応云々するならば、cold PBSでのwashは禁忌です。

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No.4650-2 - 2015/12/10 (木) 13:35:20 - 独り言

昔の知り合いは、刺激後、すぐに回収するため、培地を吸引して、液体窒素（もしくは-80度だったかな？）ですぐにdishごと凍らすということをやっていました。
培地の残りが気になるなら、Cold PBSでwashしてもいいかも。