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返事が遅くなりまして申し訳ありません。 削除/引用 No.4648-4 - 2015/12/15 (火) 19:07:10 - 実験ひとり >[Re:3] おおさんは書きました : > CAG(promoter)-(KOZAK)-この部分は自作ですか？どのようなベクターを使ってどのように作ったのですか？ > 細胞はなんですか？発現が難しい細胞を使っているなら、まずはHEKとかHeLaとかでコンストラクトを確認してみてはどうでしょうか。ポジコンはなぜ取れないのでしょうか。 > ストップコドンがなくて影響が出そうなのはIRES以降のような気がしますがGFPは発現するんですよね。。。 返事が遅くなりまして、すみません。 おおさま、ありがとうございます。 pCAGIGというベクターをaddgeneから購入しました。細胞は、HEK293T細胞なので、transfection効率は悪くないです。GFPは発現します。pCAGIGのMCSのEcoRVで切って、ブラントエンドライゲーションを続けることで、順番に入れています。（効率悪いやり方ですが、シークエンスは確認できております） >[Re:2] 独り言さんは書きました : > IRESの前に終止コドンがないと、変なタンパク質ができて、タンパク質分解が起こる可能性があります。 > > IRESとMCSの間に終止コドンを入れて、クローニングすればよいと思います。１フレーム分でも,pEGFP-C1のように３フレームに合うようにしておいてもいいし。 > > ちなみに確認のWBは予想される大きさよりももっと上のほうの位置もWBで確認しましたか？ > P2Aは切断が必ずしも効率的に起こるわけでないので、融合したままのタンパク質が発現している可能性もあります。 > 独り言様 ありがとうございます。やはり、ストップコドン抜きだと、うまく発現しない場合もあるのですね。おっしゃるとおり、A+Bになっていないか、確認しましたが、それすらもなく、困っていました。しかし、タンパク発現がうまく行くかどうかの確認は、やはり地道にストップコドンを入れたものを作った方が良いですね。

(無題) 削除/引用 No.4648-3 - 2015/12/10 (木) 17:05:56 - おお CAG(promoter)-(KOZAK)-この部分は自作ですか？どのようなベクターを使ってどのように作ったのですか？ 細胞はなんですか？発現が難しい細胞を使っているなら、まずはHEKとかHeLaとかでコンストラクトを確認してみてはどうでしょうか。ポジコンはなぜ取れないのでしょうか。 ストップコドンがなくて影響が出そうなのはIRES以降のような気がしますがGFPは発現するんですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.4648-2 - 2015/12/10 (木) 13:23:18 - 独り言 IRESの前に終止コドンがないと、変なタンパク質ができて、タンパク質分解が起こる可能性があります。 IRESとMCSの間に終止コドンを入れて、クローニングすればよいと思います。１フレーム分でも,pEGFP-C1のように３フレームに合うようにしておいてもいいし。 ちなみに確認のWBは予想される大きさよりももっと上のほうの位置もWBで確認しましたか？ P2Aは切断が必ずしも効率的に起こるわけでないので、融合したままのタンパク質が発現している可能性もあります。

IRESの前に終止コドンがない場合のタンパク発現 削除/引用 No.4648-1 - 2015/12/10 (木) 12:13:51 - 実験ひとり こんにちは。 いつもお世話になりありがとうございます。楽しく拝読させて頂いております。さて、一人でクローニングで煮詰まっており、お知恵を拝借したく思います。 発現ベクターを作成中で、具体的には、4遺伝子を同時発現させたくかつ、GFPでtransfectionされた細胞を見たいと言うことで、CAG(promoter)-(KOZAK)-A-P2A-B-T2A-C-E2A-D（終止コドンｰIRES-GFPというコンストラクトを作成中です。MCSがIRESの前にあり、X-P2A- ,Y-T2Aと1遺伝子ずつクローニングしております。 当然、P2A配列で接続している都合上、ストップコドンを削ったcDNAを組み込んでいます。念のため、P2Aを利用した2遺伝子での発現がうまく行くかどうか確認するために、CAG(promoter)-A-P2A-B-T2A-IRES GFPとCAG-A(終止コドン無し）IRES-GFP CAG-B（終止コドン無し）-IRES-GFPの3ベクターを293T細胞にtransfectionしたところ、AもBもどのベクターからも蛋白が発現しません。（シークエンスもズレはないです）GFPを発現していることは蛍光顕微鏡で確認していますので、transfection効率もさほど悪くありません。 この場合考えられるのは、endogenousなA,B蛋白を認識する当てた抗体が両方悪い可能性（positive controlの欠如）と、終止コドンがないと蛋白は当然きれいに発現しないため、P2A接続の場合は、ベクターを最後までつくるべきとも考えています。ただ、そうすると、２遺伝子発現ベクターを途中のクローニング中ベクターでは作れないということにもなりますので別で作る必要があります。 このあたり、一人で煮詰まっているため、誠に申し訳ありませんが、ご助言頂けますと幸いです。よろしくお願い申し上げます。

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