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Foxp3細胞内染色（FACS）試薬の自作 トピック削除
No.4638-TOPIC - 2015/12/06 (日) 11:58:27 - TH
マウス肺腫瘍モデルでregulatory T細胞の解析（FACS）を始めたのですが、我々の研究室で通常用いている細胞内染色用の固定透過プロトコール（1.5%PFA固定、室温15分、0.1%Triton-X、室温15分）ではFoxp3が全く検出できませんでした。慌てて調べてみたら、核内転写因子のFACS検出に特化した固定・透過用キットが各社から出ている事がわかり、いい加減に始めてしまったのが問題だった事がわかりました（当方、免疫系の解析は初めてで、周囲に免疫の研究室がない、という環境下で仕事しております）。

これらのキットから一つ選んで買えば良いとも思うのですが、固定・透過目的だけのためにのキットを買うのにかなり抵抗感があり、なんとか自作したいと思っています。PFA濃度とdetergentの選択（あるいはメタノール固定の併用）あたりがポイントのような気がするのですが、もしFoxp3のFACSを自作の固定・透過バッファーでやってらっしゃる方がいらしたら、経験を共有させて頂きけませんでしょうか？

なお、ポジコンの準備、抗体の選択（ポリクロモノクロ、標識一次抗体か二次抗体か、蛍光標識の種類、など）、この肺組織にregulatory T細胞が実際にいるのか、など色々問題があるのは承知しておりますが、今回はFoxp3 FACS用の固定・透過に絞ってご意見伺えると助かります。よろしくお願いします。
　
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No.4638-6 - 2015/12/10 (木) 23:27:44 - TH
HIHさん、 早速eBioのFJK-16sおよびバッファーキットを購入して、マウス腸間膜リンパ節のT細胞でまずはやってみようと思います。皆様、本当にありがとうございました。

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No.4638-5 - 2015/12/10 (木) 09:09:14 - HIH
抗体はマウスであればeBioのFJK-16s以外ありえません。
これならどの蛍光でも良く染まります。
ポジコンはリンパ節の細胞でも使えば良いと思いますが。

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No.4638-4 - 2015/12/09 (水) 18:01:05 - TH
TK-1さん、alphaさん、どうも有難うございます。この二日ほど、サポニンも含め、何通りか試してみたのですが、うまく行きませんでした。お二人のご意見もあわせると、ポジコンを準備してた上でキットを購入する方が得策のようですね。

バッファーの方はキットを購入するとして、抗体のクローンについても、お勧めなどありましたら、買い直したいと思うのですが、いかがでしょうか？

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No.4638-3 - 2015/12/08 (火) 11:48:20 - alpha
私もTK-1さんの意見に同意です。
以前、サポニンで染色しておりましたが、どうしても検出割合が低く、eBioのキットと比較したところ、かなりの検出割合に差があったことを覚えております。
特に、存在が割合が少ないような場合にはきちんとしたプロトコールで染めることをお勧めします。
eBioはその辺のプロトコールも提示してくれているので重宝しています。

(無題) 削除/引用
No.4638-2 - 2015/12/07 (月) 21:52:37 - TK−1
いろんな会社がキットを出してくるにはそれなりの需要があるからで、なかなか自作レベルで作れないからということです。

若干シグナルが低くてもいいなら、saponinの入ったバッファーで染められます。ただ、eBioなんかのキットに比べるとクオリティーは若干落ちます。

Foxp3細胞内染色（FACS）試薬の自作 削除/引用
No.4638-1 - 2015/12/06 (日) 11:58:27 - TH
マウス肺腫瘍モデルでregulatory T細胞の解析（FACS）を始めたのですが、我々の研究室で通常用いている細胞内染色用の固定透過プロトコール（1.5%PFA固定、室温15分、0.1%Triton-X、室温15分）ではFoxp3が全く検出できませんでした。慌てて調べてみたら、核内転写因子のFACS検出に特化した固定・透過用キットが各社から出ている事がわかり、いい加減に始めてしまったのが問題だった事がわかりました（当方、免疫系の解析は初めてで、周囲に免疫の研究室がない、という環境下で仕事しております）。

これらのキットから一つ選んで買えば良いとも思うのですが、固定・透過目的だけのためにのキットを買うのにかなり抵抗感があり、なんとか自作したいと思っています。PFA濃度とdetergentの選択（あるいはメタノール固定の併用）あたりがポイントのような気がするのですが、もしFoxp3のFACSを自作の固定・透過バッファーでやってらっしゃる方がいらしたら、経験を共有させて頂きけませんでしょうか？

なお、ポジコンの準備、抗体の選択（ポリクロモノクロ、標識一次抗体か二次抗体か、蛍光標識の種類、など）、この肺組織にregulatory T細胞が実際にいるのか、など色々問題があるのは承知しておりますが、今回はFoxp3 FACS用の固定・透過に絞ってご意見伺えると助かります。よろしくお願いします。
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