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(無題) 削除/引用 No.4637-8 - 2015/12/07 (月) 13:04:31 - おお イマイチ何がゴールなのかわからないので、、、 高濃度になると更に濃縮されるものが出てくるわけで、あぐるタンパク質も出てくるかもしれません。そうすると詰まったりすることはあるかもしれませんよ。現状の濃度でできない理由がよくわかりませんが、、、通り抜けてくるものが薄いということなら、それを更に１kとか小さい膜で濃縮する手もあります。 ゲルろ過にしろ限外濾過膜にしろ、目的のタンパク質が何か他のタンパク質などにくっついていたならば、目的のタンパク質のサイズの挙動をしめしませんし、すでに指摘があるように３０kDaでわかれるとかいてあっても実際は分子が占める空間の大きさと形で振り分けられるわけですから厳密にそこで別れることを期待できないかもしれないです。 ゲルろ過の場合もいろいろ方法があってGー５０などを使うと３０ー４０kDa以上は排除限界に来るかと思いますので、カラム素通りとカラムにその時点で残ったものという分け方も可能です。 カラムをかける時の条件はすでに指摘がありますが塩をいくらか加えたほうがいいかと思います、支持体とのの相互作用を抑えるためですがものによっては１０ー５０mMぐらいの塩化ナトリウムを入れることがおおいです。多めに入れることもあり得る方法です。塩が高いと蛋白のコンプレックスも分解されるものもありえますので、そのへんはうまくやるといろいろなことをさぐれるかもしれません。これに関しては限外ろ過でも同じようなことがいえます。ただし高すぎると疎水相互作用を強めることがありその為くっつくタンパク質も出てきます。また通常の塩濃度でも疎水結合でくっつくなら、界面活性剤なども選択肢ですが、その他に比較的マイルドなカオトロピックイオンなども使われたりします。０．５ー１MぐらいのLiClとか。

(無題) 削除/引用 No.4637-7 - 2015/12/07 (月) 11:45:26 - mon ゲルろ過法でも、カラム基材と相互作用（水素結合？？）するタンパクが極稀にあります。逆にそれを逆手にとった分画法が教科書に載っていました。 なお塩濃度を上げる(0.5Mほどだったかな)と相互作用を防ぐことができますし、望まない多量体化は界面活性剤やグリセリンを展開液に添加することで防げる時「も」あります。

(無題) 削除/引用 No.4637-6 - 2015/12/07 (月) 09:58:30 - tm たていすさん、NMさん、sssさん ご返答ありがとうございます。 やはり、ゲル濾過が正攻法ですよね、、 実は、ゲル濾過は何度かやったのですが、うまくいかなかったので、別の方法を検討しようとなったのです。 ただ、オープンカラムで自分でゲルを詰めてやっており、詰めが甘かったなど改善点もあるので、もう一度ゲル濾過でも検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4637-5 - 2015/12/07 (月) 09:27:37 - sss 限外濾過はポアサイズより大きい分子は通らなくて小さい分子が通るだけなので、分画分子量より大きい分子だとしても三次元構造が細長くなっていたりすると通りぬけてしまいます。分画分子量はあくまで目安程度にしかなりません。 例えば30kDaの分子を濃縮したい場合は、MWCO30kDaではなくMWCO10kDaのものを使った方がロスはなくなります。 逆に、膜との相互作用がある場合などは小さい分子でも通り抜けにくいこともありえます。 分画分子量近傍のタンパク質は三次元構造の影響を受けやすくなるので、ちゃんと分子量で分画したいのであれば、ゲル濾過がベストでしょう。

補足です 削除/引用 No.4637-4 - 2015/12/06 (日) 17:34:48 - NM >[Re:3] NMさんは書きました : >濃縮した後にゲルろ過にかけると思いの外、小さい分子が検出されます。ただ、濃縮後は結構な高濃度になっているので、可逆的な多量体を形成していた可能性もあります（ゲルろ過中で解離した？）。 経験上、このようなことがありました。可逆的な多量体というのは確認したわけではありませんが、高濃度条件だと非特異的な相互作用などタンパクが変な挙動をすることがあります。 > それと、失敗してもサンプルがロスしたり変性したりするわけではないので、 高濃度条件だと不可逆的に変性することがあるので撤回します。 でも、とりあえずやってみるのはよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4637-3 - 2015/12/05 (土) 21:48:56 - NM 限外ろ過の場合、分画サイズより大きい分子は上に残りますが、より小さい分子だからといって下に落ちてくるとは限りません。濃縮した後にゲルろ過にかけると思いの外、小さい分子が検出されます。ただ、濃縮後は結構な高濃度になっているので、可逆的な多量体を形成していた可能性もあります（ゲルろ過中で解離した？）。希釈を繰り返したりすれば上手くいったかもしれませんが、たていすさんの言うようにゲルろ過が正攻法だと思います。 それと、失敗してもサンプルがロスしたり変性したりするわけではないので、とりあえずやってみても良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4637-2 - 2015/12/05 (土) 18:06:01 - たていす >30000以上30000以下みたいにはっきりとは分かれていませんでした のは、どうやって調べたの？SDS-PAGEで調べたのであれば、SDS-PAGEで分子量３万ということになる。それは、ゲル濾過やモルカットで得られる分子量（ストークス半径？）とは、異なってくると思います。 モルカットは濃縮するついでに分画する程度のことなので、ゲルろ過が正攻法だろうなと思います。 モルカットで分子量１０万程度でカットして、濃縮液をSepahcrylS300(?)、濾過液をSephadexG75（？）辺りが穏当ではないかなあ？

アミコンウルトラでのタンパク質の分離 削除/引用 No.4637-1 - 2015/12/05 (土) 13:03:44 - tm タンパク質を分子量の大きさで分画しようと、色々な方法で検討しているのですが、その中でアミコンウルトラ(限外ろ過)を用いて分画も行おうと思っています。 分子量が6000〜200000ほどまでまんべんなく存在しているのですが、例えば、それを30000前後で分けようと思っています。 アミコンの説明書通りに1�r/mlの濃度で行ってみると、30000以上30000以下みたいにはっきりとは分かれていませんでしたが、2つのグループには分かれていました。 もしこの操作で、濃度を更に大きくしても、上手くいくと思いますか？ また、アミコンを用いてタンパク質の分画をしたことがある人がいましたら、どのくらいの濃度で行った等教えていただきたいです。

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