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SDSpage タンパク質の有無 削除/引用 No.4632-15 - 2015/12/07 (月) 10:56:19 - スタディこぞう 様々な、実験アドバイス誠にありがとうございました。 卒業研究に向けて、努力していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4632-14 - 2015/12/05 (土) 17:13:08 - おお >まずはwhole lysateで発現しているかどうかを確かめるというのは間違っていないと思います。 私もそう思います。その上で非変性条件下で溶出がどの程度なのみれば、発現や蛋白の安定性などを完全した方がいいのか、抽出方法を改善したほうがいいのかの判断の指標になりますし。

(無題) 削除/引用 No.4632-13 - 2015/12/05 (土) 16:07:11 - AP >蛋白質発現だけをみるならそれでよいですが、その方法だと、 >inclusion bodyになっていたとしても可溶化されて見えてしまいます。 >その蛋白質を今後、大量培養・精製する方向の研究であれば、 >loading dyeで可溶化するのではなく、超音波破砕をして >可溶化画分に出ていることを確認したほうが良いです。 まずはwhole lysateで発現しているかどうかを確かめるというのは間違っていないと思います。特に、今は「発現していない」ところから始めているので。 そのあとで可溶画分と、それだけでなく不溶画分をわけてSDS-PAGEすればいいです。どんなに条件を変えようと必ずしも可溶画分に発現できるわけでなく、inclusion bodyから回収せざるを得ない場合も少なくありません。可溶画分だけ見るのでは片手落ちになります。 このあいだ書き込んだんですが、先般、最近の融合タンパク質精製系キットのマニュアルを読む機会があって、不溶画分に発現する可能性があるとか、それをどうやって確かめるとか、そういう場合どうするとか、一切、書いてなくてびっくりしました。モノが不溶性画分にどんだけ行ってしまおうと、可溶画分がどんだけすくなくても、ともかく可溶上清をカラムにかけて精製するという一本道なんです。ごく一部、わずかしか可溶画分にないならスケールをあげて力技で集めてくれ、ってことみたいですね。

(無題) 削除/引用 No.4632-11 - 2015/12/05 (土) 13:26:55 - うーん 蛋白質発現だけをみるならそれでよいですが、その方法だと、 inclusion bodyになっていたとしても可溶化されて見えてしまいます。 その蛋白質を今後、大量培養・精製する方向の研究であれば、 loading dyeで可溶化するのではなく、超音波破砕をして 可溶化画分に出ていることを確認したほうが良いです。 また、今後、精製するのであれば、菌体のSDS-PAGEで全く見えないものを 取ってくるのはそれなりに大変なので、ウェスタンと同時に 菌体や誘導条件のスクリーニングをやったほうがいいです。 実験の目的がわからないので、余計なことかもしれませんが・・・ みなさんおっしゃるように初学者のように見受けられますので、 まずはどこか相談に乗ってくれる人を探したらどうでしょうか。 バイオの実験は難しい実験操作や理論があんまりないので、 ちょっと知ってるくらいの方が逆に、あんなことは誰でもできると おっしゃったりします。 しかし、だからこそ、細かなコツが無数にあって、実験を一から 立ち上げるのは大変な仕事です。もし、そういう実験をしなければ ならない立場でないなら、周囲をうまく使ったほうが早道ですよ。

(無題) 削除/引用 No.4632-10 - 2015/12/04 (金) 09:57:26 - AP 発現のチェックをする程度なら大腸菌をサンプルバッファーに懸濁して加熱するだけで十分です。DNAのため粘稠になりますが遠心して上澄みのサラサラしたところだけ使えば間に合います。ちゃんとやるなら粘性が十分に下がるまで注射針を通したり超音波を当てるなりしてDNAを物理的にせん断します。 誘導をかけてもCBB染色では発現誘導されたタンパク質のバンドが確認できないことはちょくちょくあります。ウエスタンブロットしてようやく検出できるレベルとか。何事も教科書通り、マニュアルの記載通りにはいくとは限りません。ちょっとしたことで改善することはありますが（クローニングサイトを変える、インサートをちょっと削るとか）、どうしても難しいものはししようがないです。発現誘導されたタンパク質が大腸菌を殺してしまったりとか。 ウェスタンでようやく検出できるレベルだと精製して十分量とるのは難しいいですが、必要量がとれるまで培養スケールをあげてなんとかするという力技でやることもあります。宿主ベクター系をまるっきり変えるというというのが案外と近道です。

SDSpage タンパク質の有無 削除/引用 No.4632-9 - 2015/12/04 (金) 09:46:33 - スタディこぞう おお様 ご返信ありがとうございます。 ウエスタンブロッティングによる実験はまだ行ったことがないため、周りの方にご指導していただきたいと思います。 フレンチプレスや超音波などでも可能ということなので試してみたいと思います。 貴重な実験アドバイス誠にありがとうございました。

SDSpage タンパク質の有無 削除/引用 No.4632-8 - 2015/12/04 (金) 09:39:47 - スタディこぞう sds様 ご返信ありがとうございます。 Loading Dye(Laemmli Sample buffer)を使用し、98℃で3分間加熱しています。 また、BL21(DE3)を使用しております。 貴重な実験アドバイス誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4632-7 - 2015/12/03 (木) 23:22:35 - おお >SDSpageで確認しようと試みたのですが、時間経過(0h.2h.4h.6h〜24h)ごとのレーンをみてもタンパク質が増加したと思われるレーンがありませんでした。 これはよくあることですよ。蛋白によっては大腸菌が効率よく作ってくれないか、分解が早いか何らかの理由でカタログで示されているようなGSTなどのようには行かないことはよくあることです。そういう場合はWBでないと検出できないか、気がつかないでしょう。特にサイズが大きい時にありがちです >一つの考察としては、タンパク質は作っているが、分解されてなくなり、他の菌の阻害 他の菌ってなんでしょうか。不必要な物を合成しているため、その菌自体にストレスがかかって増えにくいんだと思いますけど。 たしかにSDSサンプルバッファーを加えるとねんちょうになります。その時点で菌は溶けているのでlysozymeを使う必要はあまり感じませんし、使ってもねんちょうにな溶液になるでしょう。量が比較的あるなら、一番安易で簡単な方法はニードル２３Gー２５Gあたりにシリンジなんかで数回通してねばねばしている原因のDNAを切ってしまえばいいです。 フレンチプレスや超音波（結構強め）などでも対応できます。

(無題) 削除/引用 No.4632-6 - 2015/12/03 (木) 23:01:33 - sds Loading Dyeは、Laemmli Sample bufferのことですかね？ 加熱はしてますか？ 大腸菌は細胞壁があるので、Sample bufferだけだと不十分かもしれません。 普通はlysozymeを使います。 pLysS株を用いているなら、凍結融解でも十分溶菌できます。 粘性の原因はDNAなので、benzonaseなどを入れると改善します。 少なくとも、用いている大腸菌がBL21(DE3)なのか、ただのBL21なのか正確にわかっていますか？ 全部自分で立ち上げないといけないような状況であれば仕方ないですが、ラボで普通にやっていることなら、他の方が指摘されているようにラボの人の指導を仰ぐべきでしょうね。

SDSpage タンパク質の有無について 削除/引用 No.4632-5 - 2015/12/03 (木) 22:40:38 - スタディこぞう T-2様 ご返信ありがとうございます。 本当に申し訳ありません。まだまだ、私が未熟であるため実験方法の確立もできていない状況です。 以下に培養・実験条件などを記載しておりますので、ご教授していただければ幸いです。 タンパク質(pET14bを含む)という言い方を使わせていただいたのは、インサート部分に今までの研究にはない遺伝子の配列を組み込んでおり、省略させていただきました。 菌の破砕についてのアドバイス誠にありがとうございます。参考にさせていただきます。 〈実験概要〉 プレートからコロニーを一つとり、LB溶液3mL+Amp3μLの入った試験管で一晩培養 ↓ Tb溶液50mL+Amp50μL(以下37℃条件)で培養し、30分後ごとにODを確認(セルに滅菌水900μL+培養液100μL)し、ODが0.5以上となった時、IPTG(0.1M)を50μL添加。 ↓ IPTGを入れてから2時間後、1.5mLをとり遠心する。その後再びIPTG(0.1M)を50μL添加し、2時間後以降同じ操作を繰り返す。(ODを含め2h、4h、〜24hまでのデータをとりました。) ↓ 遠心したチューブの培養液を取り除き、1×Loading dyeを50μL入れ、SDS-pageで確認しました。

(無題) 削除/引用 No.4632-4 - 2015/12/03 (木) 17:55:45 - NM > 目的物質のタンパク質(pET14bを含む)の有無を確認したいため、培養後、タンパク質を保有していると思われる菌体(BL21)に1×Loading dyeを注入して、SDSpageで確認しようと試みたのですが、時間経過(0h.2h.4h.6h〜24h)ごとのレーンをみてもタンパク質が増加したと思われるレーンがありませんでした。 培養・実験条件がほとんど書かれていないのでアドバイスできません。 ”タンパク質(pET14bを含む)”という書き方から、理解して実験できているかが不安です。 > IPTGを添加すると、OD600の値はIPTG添加なしのものと比べると低い値であり、一つの考察としては、タンパク質は作っているが、分解されてなくなり、他の菌の阻害となってしまっているのではないかと考えました。 この文章もよく理解できません。IPTGをいつ添加したのか、いつ比べたのか。 分解されたタンパク質が他の菌の阻害になるという仮説も無理があると思います。 > また、菌体に粘性があるためアプライも苦労しており、菌の破砕を行ないたいのですが、どのように行うのかがわかりません。 菌の破砕には、超音波やフレンチプレス、あるいはBugBusterという商品もあります。 菌体内のタンパク質の調製が目的なのに方法がわからないというのがわかりません。随分と行き当たりばったりではありませんか？ 初学者の方だと思うので、実験指導者にアドバイスをもらった方が良いと思います。

SDSpage タンパク質の有無 削除/引用 No.4632-3 - 2015/12/03 (木) 17:32:48 - スタディこぞう T-2様 ご返信ありがとうございます。 IPTGを添加した時間経過で実験を行っており、濃度は0.1Mを使用しております。 BL21ではpETベクターは適さないということでしたが、論文をもう一度読み直してみます。

(無題) 削除/引用 No.4632-2 - 2015/12/03 (木) 17:02:16 - T-2 まず、落ち着いてご自分の書いた文章を見なおしてみてください。 やろうとしていることはわかりますが、大切な情報が抜けていると思います。 菌株は本当にBL21ですか？BL21はpETベクターには適しません。 時間経過とはIPTGを添加してからですか？その濃度は？ 企業、大学など殆どの施設は組換えDNA実験を行うには申請が必要で 責任者がいると思いますが、そのような方にまずは相談されてはいかがでしょうか。

SDSpage タンパク質の有無 削除/引用 No.4632-1 - 2015/12/03 (木) 16:28:43 - スタディこぞう はじめまして 目的物質のタンパク質(pET14bを含む)の有無を確認したいため、培養後、タンパク質を保有していると思われる菌体(BL21)に1×Loading dyeを注入して、SDSpageで確認しようと試みたのですが、時間経過(0h.2h.4h.6h〜24h)ごとのレーンをみてもタンパク質が増加したと思われるレーンがありませんでした。 IPTGを添加すると、OD600の値はIPTG添加なしのものと比べると低い値であり、一つの考察としては、タンパク質は作っているが、分解されてなくなり、他の菌の阻害となってしまっているのではないかと考えました。 タンパク質の有無をウエスタンブロッティング前に確認するためには、どうしたらよいのでしょうか。 また、菌体に粘性があるためアプライも苦労しており、菌の破砕を行ないたいのですが、どのように行うのかがわかりません。アドバイスしていただける方、よろしくお願いいたします。

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