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(無題) 削除/引用 No.4628-20 - 2021/11/15 (月) 12:41:37 - しおりん totoさん、ご経験からくる情報をshareしていただいてありがとうございます。このシステムが苦手とするケースもあるのだから執着しすぎないということを意識するようにします。

(無題) 削除/引用 No.4628-19 - 2021/11/14 (日) 15:53:29 - toto 指摘されてる活性の低下はGibsom assemblyで特にひどかったですが、NEBuilderでもある程度は起きます。それで、メーカー推奨の−20度保存はやめて、−80度においてます。この状態では安定なようです。 全く妙なものができる例として、レトロのパッケージングベクターがそうでした。このベクターでは一度も正しいものがとれてません。おそらくリピートのせいでしょうが、レンチでは難なくとれるのがちょっと不思議ですが。そういう場合は古典的な制限酵素ーligationにしてます。原理的に仕方ないのでしょう。 もう一つの例は、mutationサイトを入れる際で、inversePCRでよくやりますが、全くダメなことも1〜2割くらいの確率で起きてます。これは配列をずらすことで解決できます。 それと、反応温度は50度でなく、45度でやってます。スケールを全量4uLとけちってるからなのかもしれませんが、このほうが勝率がよかったので。この辺は試行錯誤で、皆さんいろいろと工夫されてると思います。

(無題) 削除/引用 No.4628-18 - 2021/11/14 (日) 15:13:36 - しおりん カートン142さん、ありがとうございます。原因がわからないのはちょっと怖いですが、上手くいかないときには別法に切り替えることも検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4628-17 - 2021/11/14 (日) 13:46:40 - カートン142 本質とは少しずれますが、 ・つないだ合計が10kbを超えると大腸菌でのクローニング効率が目に見えて落ちる ・市販のコンピでもロットと購入からの経過時間次第でCompetencyがガタ落ちする ということがあるのでご注意ください。 この辺でトラブったことがあり、In FusionでもNEBuilder HiFiでもまともにコロニーが取れず、取れてもサイズの小さい妙なプラスミドに化けている、というような時期がありました。

(無題) 削除/引用 No.4628-16 - 2021/11/13 (土) 19:02:42 - しおりん totoさん、ありがとうございます！ コンストラクションはほとんどNEBuilderに置き換えておられるということですね。また、NEBuilderでつないでおいてPCRをすることで、基本的に2 fragmentの反応に持ち込んだ方が効率が良いとのご経験、たいへん参考になります。コストダウンのためのtipsもぜひ導入させていただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4628-15 - 2021/11/13 (土) 16:50:16 - toto まだおります。。。これはNEBuilderを導入した時期だったようですね。当初、いろいろと調べてましたが、結局、そのまま、NEBuilderに変更して、以来、100以上のコンストラクトを作ってきました。 なおここにあるような３フラグメントアッセンブリは最近ではあまりやっておらず、2フラグメントをin vitroでBuilderしておいてPCRでつながったものだけを増やしてそれをベクターに入れる、二段階Buiderしてます。どうしも効率は３フラグメントアッセンブリでは落ちるので。 このとき書いた変異ですが、これはオーバーラップ部位近辺でした。なぜ起きたのかはわからないですが、２フラグメントではあまりおきない印象があります。ただたまに、全く妙な組み替えが起きることがありますが、そういうのは特定の配列の組み合わせ限定なので、さっさと別の配列を使う事にしてます。 NEBuilderは2uLずつに分注して−80度で保存して使ってるので、コストはほぼオリゴ代、という感じです。今でもたまにligationを使う事もありますが、コンストラクトは随分楽になりました。周辺配列までオリゴのものと置き換えられるのがとても便利です。

(無題) 削除/引用 No.4628-14 - 2021/11/12 (金) 23:57:39 - しおりん 古いトピックで、書き込んだ方々はもう読んでおられないかもしれないのですが、私たちも遅ればせながら制限酵素／リガーゼに頼らないクローニングを導入しようとしています。 このトピックを読んで、totoさんが経験されたNEBuilderのトラブルが気になっています。おっしゃっている欠損や変異というのは、オーバーラップ部位に生じたものなのでしょうか。元と産物の配列の比較からメカニズムが想定できないでしょうか。 新しくお読みになった方でも、これらの方法の使用感についてご意見をお聞かせいただければ幸いです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4628-13 - 2015/12/22 (火) 23:30:52 - toto monさん、 ええ、そうなんですが、今後、どちらを使ったほうがいいのかを知っておきたいので。Builderが5'ミスマッチにtolerantというのは、確かにメリットで、他のところで妙なエラーを起こさないのならこちらに一本化したいところです。今、キャンペーンでGibsonより安いですし。

(無題) 削除/引用 No.4628-12 - 2015/12/22 (火) 20:58:31 - mon totoさん、そこまで検証しなくてもこういう事例がありましたと報告すれば良いと思いますよ。 もし、NEBからレスポンスがありサンプル・配列情報を渡しても良いなら、検証はNEBに任せれば良いのでは。

(無題) 削除/引用 No.4628-11 - 2015/12/22 (火) 13:16:05 - toto monさん、ありがとうございます。そうですね、３フラグメントアッセンブリとはいえ、欠損は見たことがなかったので、気になりました。Gibsonと全く同じ条件で比較して、Builderで異常の多いのが確認されれば、NEBに言ってみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4628-10 - 2015/12/22 (火) 07:19:01 - mon totoさん、ご報告ありがとうございます。 私の場合は、100%(6/6)正しい配列のものが取れました。 totoさんの結果はNEBに報告した方が良いかも。

NEBuilder HiFiDNA 削除/引用 No.4628-9 - 2015/12/21 (月) 22:01:22 - toto 随分下に行ってしまったのであげます。ここに書いた、NEBのGibsonAssemblyの後継とされているNEBuilderをいくつかのコンストラクトで使った結果です。1Kbの異なるフラグメントAとBをoverlapを20bpつけてDNA合成して、A+Bをベクターに入れるというコンストラクションで、合成DNAの２つを（PCRなしに）消化したベクターと混ぜた場合、いずれのコロニーも正しくつながってはいました。が、insertの中に1-2塩基の欠損のあるものが3割、変異のあるものが4割もありました。正しいORFのものが取れて入るから良いですが、合成DNAのミスは滅多に遭遇せず、Gibsonで同じようなコンストラクションすると変異も欠損もまず出ないので、がっかりでした。 別の0.5Kと1Kの合成DNAフラグメントを同時にベクターに入れるというのNEBuilderでやったところ、なぜか正しくつながったものがとれず、結局、それぞれをPCRで揃えて、GibsonAssemblyでやり直したら、100%正しい配列のがとれました。PCRしたものををBuilderでやればどうなるかはわかりませんが、BuilderはほんとうにGibsonの改良版なのかという気がしてきました。たまたまなのかはわからないのですが、他に使われた方がおられたら、結果を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4628-8 - 2015/12/04 (金) 17:36:01 - み momさん、totoさん ありがとうございます。 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitは知りませんでした。 これが一番良さ気ですね。 すでに旧Gibson assembly kitを発注してしまっていて納品されてしまうました。。。 金欠なのでしばらくこれで頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.4628-7 - 2015/12/03 (木) 21:47:18 - toto monさんの紹介された、このNEBの新しいのはよさげですね。5', 3' mismatchを除いてくれるのが合成DNAをつなぐときに便利そうです。１Kの5本のDNAフラグメントとベクターを、つまり6本を同時に11/12の確率でつないでくれるというのがほんとなら、すごい。ただ、この名前はなんとかならないものかと思いますが。早速買ってみます。

(無題) 削除/引用 No.4628-6 - 2015/12/03 (木) 20:16:42 - mon NEBはギブソンアッセンブリーの後継として、NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitを押してますね。 同じDNAで比較したわけではないのですが、Infusionより効率は良いような気がします。 (Manualの1/5量＝total 4uLで使っています。）

(無題) 削除/引用 No.4628-5 - 2015/12/03 (木) 19:50:28 - み totoさんコメント有難うございます。 gibson良さ気ですね。 調べていたら以下のようなものもありました。 Thermo社 GeneArt High-Order Genetic assembly system GeneArt Seamless PLUS cloning and Assembly kit

(無題) 削除/引用 No.4628-4 - 2015/12/03 (木) 10:39:42 - toto InFusionからGibsonに乗り換えたのは、MPさんの書かれたように効率の高さです。subcloningではあり得ないくらい大量のコロニーが生えてほぼ全勝です。また、組成も、これの原報のラボで公開されているので、自分で作ることもできて、全くブラックボックスなInFusionより、気持ち的に安心できます。またオーバーラップ部分の長さを20-25merにできるせいなのか、15merと指定されてるInFusionよりおかしなつなぎ方になる頻度が減ります。メーカー推奨の1/4の反応スケールでやってるので、とても安くできてます。InFusionも悪くないのですが。 　 Gibsonで4Kbのインサートをベクターにつないだことありますが、普通にできました。というか、ベクターの長さが普通はそれくらいなので、４Kくらいならできるはずと思いますが。ただ、みさんの質問のような10-15kbとなると、さすがにどうでしょうか。オーバーラップ配列に相同な部分がその中になければできるのかもしれませんが。結果を知りたいところです。

(無題) 削除/引用 No.4628-3 - 2015/12/03 (木) 09:44:46 - み >[Re:2] MPさんは書きました : > ギブソンに１票。 > in fusionより明らかに効率がよい。コストに関してはわかりません。 有難うございます。 Takara社の営業マンに聞いたところIn fusion(Takara製品）でもgibson(NEB製品）でもせいぜい２kb断片を繋ぎあわせるのがやっとだとか言っていましたがどうなのでしょうか？ NEB Web pageでのgibson製品の説明では5kbでも可能なデータが記載されています。 価格もgibsonが安いです。In fusionもまあまあ安い。

(無題) 削除/引用 No.4628-2 - 2015/12/03 (木) 08:55:44 - MP ギブソンに１票。 in fusionより明らかに効率がよい。コストに関してはわかりません。

制限酵素処理なしクローニング 削除/引用 No.4628-1 - 2015/12/02 (水) 09:33:56 - み ギブソンアッセンブリー、In fusion、Gene artなど制限酵素処理なしで相同配列を利用してDNAを繋げる方法でPCR産物をベクターにクローニングする場合、試薬会社から購入できるものの中で使用感が良いものはどれでしょうか？ 特にインサート（クローニングしたい遺伝子）10-15kbとベクター(5kbくらい）を繋げたいと考えています。

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