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(無題) 削除/引用 No.4625-7 - 2015/12/02 (水) 19:37:19 - AA >70%エタノールでペレットをリンスしてwashする際には30%ほど水分が残っているので加水分解されえますよね？ その人の言によれば70％エタノールで良いということでした。 ペレット状態であって溶解しているわけではないのでということでしょうか。 実際、1ヶ月ほど後続サンプルを待ったケースがありましたが、 いわゆるRIN値は遜色ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4625-6 - 2015/12/02 (水) 15:59:45 - おお >100% エタノールでの沈殿ではなくイソプロの方が沈殿効率がよいのですね。ここら辺は指南書によるのでしょうか。 指南書が何通りかあるのかはよくわかりませんけど、私はtrizol付属のマニュアルに沿ってやっていますのでイソプロ以外の方法は見たことがありません。 収量についてあまり記述を見たことがありませんが、メインな夾雑物である蛋白はエタノールを加えるより、イソプロパノールを加えるほうが共沈しにくいです。Trizolのプロトコールはどうだったかわかりませんが、DNAの精製の初期段階での沈殿はイソプロを使うことが多く、なるべく室温で無駄に時間を置かないで遠心して回収するほうがコンタミする蛋白の量が少ないのでそのように書かれているプロトコールはまあまああるのではないかと思います。同様にRNAもイソプロを入れた時点で止めずに遠心してしまった方がきれいなRNAが取れると思います。 なのでイソプロ沈のあと７０％エタノールを沈殿に加えてから保存というやり方が推奨されているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.4625-5 - 2015/12/02 (水) 15:48:13 - ポン子 おおさん お返事ありがとうございます。 トリゾルのプロトコルを読むと、トリゾルを加えて-80度で保存か、エタチン後に保存が可能なようですね。そして、100% エタノールでの沈殿ではなくイソプロの方が沈殿効率がよいのですね。ここら辺は指南書によるのでしょうか。 トリゾルで細胞を溶かして、それを-80度で保存することにします。ありがとうございました。 seventhさん ありがとうございます。トリゾルの説明書を読まずして実験の指南書を読んでいました。間抜けでした…トリゾルで溶かして-80度で保存します。ありがとうございます。 AAさん とても具体的なお返事ありがとうございます。 > ペレット状態でエタノール中にプカプカしている状態が一番安定らしいです。 RNAは加水分解されるので水分がなければ大丈夫ということなのだろうと解釈しています。 70%エタノールでペレットをリンスしてwashする際には30%ほど水分が残っているので加水分解されえますよね？

(無題) 削除/引用 No.4625-4 - 2015/12/02 (水) 15:39:11 - AA Leic○社のレーザーダイセクションの担当の学術サービスが言ってたのですが、 ペレット状態でエタノール中にプカプカしている状態が一番安定らしいです。 RNAは加水分解されるので水分がなければ大丈夫ということなのだろうと解釈しています。

(無題) 削除/引用 No.4625-3 - 2015/12/02 (水) 10:12:00 - seventh とりあえずtrizolのマニュアルぐらいは読んで下さい。 RNA抽出の場合、生体内のRNaseを不活性化させるまでが一番不安定なので最低限そこまでのステップまでは進めたほうが良いです。

(無題) 削除/引用 No.4625-2 - 2015/12/02 (水) 04:39:05 - おお >[Re:1] ポン子さんは書きました : > 細胞をtrypsinで剥がして培地で中和後、遠心した細胞の沈殿を-80度保存がいいのか、 少なくともこれはあまりよくないです。trizolにけんだくしたじょうたいか(クロロフォルムをいれず)、イソプロで沈殿して上澄みをのぞいた状態(70%エタノールを加えるとなおよい)がよいと思います。Trizolのプロダクトマニュアルとかにどこで止めれるとかかいてないかなぁ。。。もう一度読み直してみては。 > もう一点は、RNA seqの業者の方から「トリゾルで回収したtotal RNA 1 ugをエタノール沈殿させて、少しエタノールを残したままでドライアイスに入れて送るように」と言われています。この実験方法としては、トリゾルを加えて、20%量のクロロホルムを加えて激しく混ぜたのち遠心して、上清を回収して100%エタノールを加えて、15分室温放置して、マックス遠心して上清を除いて、70%エタノールで優しく上下に混ぜたのちに遠心したペレットをドライアイスに送ればよいという理解で大丈夫ですしょうか？すごく初歩的なことで実験指南書どおりに行いたいですが、本によって書かれてあることはまちまちなのでRT-PCRとRNA seqどちらでもいけるサンプルの準備方法を教えていただくことができないかと質問いたしました。 それは業者と確認してください。こちらの想像で違ったことをかいて、その通りやったら違ったってなんて事になるとこちらも困りますから。 ただ少なくとも言えることはTrizolけんだく、クロロフォルム添加、水層をとってイソプロで沈殿、70%エタノールで洗ったあと適切なバッファーで溶解したあとやっとRNA量が測れる状態になると思います。

タイムコース実験でのRNA seq/RT-PCR用のRNAの保存方法 削除/引用 No.4625-1 - 2015/12/02 (水) 03:12:10 - ポン子 こんばんは。初歩的な内容だと思うのですが質問させて下さい。 ２種類の培養細胞からRNAを回収したいです。その後、特定の遺伝子の発現をRT-PCRにて、また網羅的なRNAの発現をRNA seq（ncRNAも見ます）にて検討予定です。 ２つほど質問があるのですが、まだ実験を初めて間もないので一つ以上の細胞を同時に扱うことを許可されておりません。一つ目の細胞からRNAを回収し終えたのち、二つ目の細胞を先輩から譲り受けることになっています。 ２種類の細胞を同時に逆転写したいのですが、１つ目の細胞はそれまでにどうやって保存すべきか悩んでいます。細胞は6穴プレートにまいた接着細胞で、トリゾルを加えてパイペット後、エッペンチューブに移したものを-80度保存がいいのか（クロロホルムを加えず？）、細胞をtrypsinで剥がして培地で中和後、遠心した細胞の沈殿を-80度保存がいいのか、それとも液体窒素中での保存がいいのか、選択肢がありすぎてどれがよいのかご指導くださいませんでしょうか？ もう一点は、RNA seqの業者の方から「トリゾルで回収したtotal RNA 1 ugをエタノール沈殿させて、少しエタノールを残したままでドライアイスに入れて送るように」と言われています。この実験方法としては、トリゾルを加えて、20%量のクロロホルムを加えて激しく混ぜたのち遠心して、上清を回収して100%エタノールを加えて、15分室温放置して、マックス遠心して上清を除いて、70%エタノールで優しく上下に混ぜたのちに遠心したペレットをドライアイスに送ればよいという理解で大丈夫ですしょうか？すごく初歩的なことで実験指南書どおりに行いたいですが、本によって書かれてあることはまちまちなのでRT-PCRとRNA seqどちらでもいけるサンプルの準備方法を教えていただくことができないかと質問いたしました。 長文で読み難いことと思いますが、よろしくお願いします。

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