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(無題) 削除/引用 No.4624-3 - 2015/12/03 (木) 01:42:42 - くぁwせdrftぎゅいおp 2が指摘するように、negative controlでnormalあるいはnon-related IgGでIPして電気泳動して、今回切出したのとおなじあたりの分子量位置を切出しておなじようにMSで分析して、差し引きすれば、候補はかなり減るとおもうんだが。てか、精製度が高いほど絞り込む候補蛋白質も格段に減るので、とりあえず精製度あげる工夫はした方がいい。あとは抗体買って抗体-IPとcontrol IPそれぞれの精製物をimmuno pull downして検証すればいい。予算と設備的な面からみて、アミノ酸同位体標識して定量的proteomicsとか出来るならばそれでやるのが一番いいんだが。外注もあるけど。

(無題) 削除/引用 No.4624-2 - 2015/12/02 (水) 01:42:31 - おお ネガティブコントロールで同じ位置のゲルをMSしてますか? まあ全部ついているかもしれませんから、タグ付きプラスミドをそろえてもいいんじゃないかな。50種類とかだとちょっと作業が大変だけど10個程度なら平行にconstructionできるでしょうし、addgeneや発表されたタグ付きプラスミドなども手に入れることができるでしょうし、そのたorigeneなんかも各種取り揃えていると思います。まあメジャーなモデル生物のベクターですけど。 そのほかのパラメーターとしては新規性、サイズとcoverage。これらで優先順位をある程度決めていいかもしれません。ただサイズは特に絶対でないのでパラメーターに入れない方がいいというひともいます。

IP後質量分析の絞り込み 削除/引用 No.4624-1 - 2015/12/02 (水) 01:09:13 - MS/MS お世話になっております。 IP後バンドを切り出しLC-MS/MSを行ったところ、 それでも十数種のタンパクが検出されました。 銀染色でもかなり精製できていると思っていたため、 予想以上に多くが検出されてしまいました。 皆さまはIP、LC-MS/MS後の候補の絞り込みってどのようにされていますか？

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