この度、human iPSCからMSCの分化誘導を行うことになりました。
human iPSCはmTeSR1培地を用いて培養しており、未分化を維持した培養そのものはうまくできています。
論文にならい、マトリジェルコートした6-well plateにhumna iPSCsをmTeSR1+Rock inhibitorにて懸濁し、通常のように播種しました。iPSCのコンフレンシーが50%にきたところで、MSC誘導培地（10% qualified FBS+ P/S in low Glucose DMEM)に変え14日間培養するというものです。
ところが私が行うと、培地交換24時間目で明らかにiPSCの形態が変わり分化が始まっているように思えますが、増殖が止まらず約48時間でwellが100%のコンフレンシーになりました。
そこで本来14日目に行うパッセージをしてみました。具体的にはゼラチンコートしたdishにtrypsin処理した細胞を播種するというものです。
すると翌朝、ほとんどの細胞が死んでいました。
そこでお聞きしたい点がありまして、トピックを立てさせていただきました。
1. iPSCから分化誘導させる際には、コンフレンシーが100%に達してもそもまま数日培地交換のみしておけばいいのでしょうか？（コンフレンシーを気にせずということです）
2. ここでほとんど全ての細胞が死んでしまったのは、かなりの細胞がまだiPSCのままの可能性があると思われますでしょうか？0.25% Trypsin/EDTAを3分処理して、その後遠心して、再度懸濁するというやりかたをとっています。
もしみなさまの中で、同じような実験をさせてる方がみえましたが、情報をシェアしていただけませんでしょうか？どうか、宜しくお願い申し上げます。 |
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