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(無題) 削除/引用 No.4609-6 - 2015/11/26 (木) 16:31:19 - 独り言 細胞粗抽出液に含まれる不純物がPCRの効率に影響することを予想しているのであれば、 プラスミドをもっていない細胞の粗抽出液と精製したプラスミドを混ぜて検量線をつくればよいと思う。

(無題) 削除/引用 No.4609-5 - 2015/11/26 (木) 09:10:45 - maro おおさん どうもありがとうございます。 希釈してやってみることにします。

(無題) 削除/引用 No.4609-4 - 2015/11/26 (木) 00:06:40 - おお ２倍希釈して、効率が検量線をとったものと変わらないならそれでイイんじゃないでしょうか。ただ希釈を単なんバッファーでやるか、プラスミドフリーの試料からの同じ画分でやるかは一度考えてみたほうがいいかもしれませんけど。ある程度希釈によりキャラクタライズして Ct値でどの範囲で直線性が得られるか確認して、その範囲で検出するようにしている人も RTPCRでは多いようです。 プラスミドが入ってない試料をカラム精製したあとにプラスミドを入れて検量線を引いた場合、他のサンプルと同様な環境で検量線が引けていると思うならそれでもいいかと。

(無題) 削除/引用 No.4609-3 - 2015/11/25 (水) 23:14:45 - maro おおさん 早速回答いただきありがとうございます。 具体的にはどうすればよいですか？ 2倍ずつの希釈系列を作ってCt値が1ずつずれるような点でのCt値を検量線にあてはめれば良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4609-2 - 2015/11/25 (水) 22:58:41 - おお 希釈系列を作ればわかるんじゃないの？

リアルタイムPCRで未知試料を定量する際の増幅効率？ 削除/引用 No.4609-1 - 2015/11/25 (水) 22:11:13 - maro リアルタイムで絶対定量する際には検量線用と未知試料とで増幅効率が同じである必要がありますが、未知試料の増幅効率が検量線を引いたときと同じかどうか調べたいです。 実験としてはプラスミド保持細胞を破砕し、あるタンパクを精製し、その時に共精製されるプラスミドDNAの量を知りたいです。 プラスミドは2種類あり、それぞれ別の細胞に持たせ、それぞれ破砕し共精製してきます。 この2種類のプラスミドで共精製される割合を調べたいです。 細胞粗抽出液とそれをカラムにかけた後のプラスミドDNA量をリアルタイムで絶対定量します。 検量線は別途精製した濃度既知のきれいなプラスミド溶液を使います。 細胞粗抽出液をそのままリアルタイムするので、きれいなプラスミド溶液を使ったリアルタイムと比較して増幅効率が違う可能性が高いので実際に増幅効率を調べたいのですが、どのようにすれば良いでしょうか？ ご意見よろしくお願いいたします。

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