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WBでのバンドの位置とprotease トピック削除
No.4600-TOPIC - 2015/11/18 (水) 11:41:48 - あぽー
いつも参考にさせて頂いています。

現在、平滑筋細胞から内因性のある膜タンパク質をWBで検出しようとしているのですが、想定されるサイズにバンドが検出されません。しかし、その半分くらいのサイズの場所にはきれいにバンドが出ています。
HEK293細胞で過剰発現させたサンプルでのWBでは、想定されるサイズにバンドが検出できていましたので、抗体は問題ないと考えています。
また、文献的にcalpainで半分くらいに切断されるとの報告がありますが、一応システインプロテアーゼ阻害剤としてPMSF、LeupeptinをLysis Bufferに加えています。

そこで質問なのですが、
@calpainを抑えたい場合、PMSF、Leupeptinに加えcalpeptinなどのcalpain阻害剤をさらに加える必要があるのでしょうか？
A他のproteaseの影響、実験条件等何か他の原因を考慮すべきところがありますか？

宜しくお願い致しますm(_ _)m
　
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(無題) 削除/引用
No.4600-14 - 2015/11/19 (木) 01:29:23 - おお
そうそう。カルパインはカルシウム依存的に活性化することがあるようだからEDTAやEGTAとか加えてなかったら入れてみるといいかも知れん。

WB re-probing 削除/引用
No.4600-13 - 2015/11/19 (木) 00:41:27 - おお
>やはりプロテアーゼが原因でバンドサイズが変わることもあるのですね…。

私の場合はサイズが変わるということでなく、検出できる蛋白量がかわりました。ものによってはサイズはかわるでしょうけど。

>一応、基本的には切れていない状態で機能しているものなので、サンプリング前には切れていないものがほとんどだと思います。

それはspeculationの枠を超えないのでは?一度変性剤が入った状態とかTCAなどでlysateを得て確認された方がいいかと思います。

>ちなみに、E64等をさらに加えたとのことですが、カクテル中のシステインプロテアー>ゼインヒビターでは不十分なこともあるのでしょうか？

万能なものはないと思った方がいいかと思います。システインプロテアーゼインヒビターといっても、すべてのものを一様にブロックするとは限らないですよ。

rocheのやつはイーストなどプロテアーゼ活性が強いものには1tablet/7mlぐらいまで濃い濃度でつかうえることもかかれていますので(具体的な数字は一度ご確認を)、濃度をあげてみるのは手かと思いますけど。

(無題) 削除/引用
No.4600-12 - 2015/11/18 (水) 23:27:31 - $£
インヒビタは入れまくっても働いてしまうときは働いてしまうし、なにも入れてなくてもほとんど全く壊れないことのほうがむしろ大半で、いれてはいるもののあまりありがたみを感じないです。やっぱここはプロテアーゼの働く隙を与えないように、2%SDSとか強力な変性剤を含むbufferで可溶化して、とっととフリーズするか早々に加熱処理したほうがいいのではないでしょうか。
disruptionする際のアーティフィシャルな分解でなくて、前の生きた細胞内の生理的な環境ですでにそのような切れたformになっているということはないでしょうか。ならば生物学的に意味のある重要なobservationでは、とおもいますがどうでしょうか。
ただ膜蛋白質は加熱処理でSDSいれててもかたまるやつがたまにいるので、加熱はかならずしも適切でないこともありますが。TCAなどの酸で変性という方法もときどき見ますが、強塩基性蛋白質とかちゃんと沈殿できるかなあどうかなとおもいます。TCAによる蛋白質の沈殿はアセトンなどで洗浄して除酸してから溶かすわけですが、沈殿がSDSでもなかなか溶けなくて困るときがあります。

(無題) 削除/引用
No.4600-11 - 2015/11/18 (水) 18:09:32 - inc
TCA処理して回収したらどうだろう

(無題) 削除/引用
No.4600-10 - 2015/11/18 (水) 17:44:38 - あぽー
皆様、たくさんのご意見ありがとうございます。

み様
> カルパインが問題ならLysis bufferにEDTAを入れておけば良い。

Caをキレートしてカルパインの活性を抑制する、という認識で宜しいでしょうか？
私もEDTAはどうだろうと考えたのですが、私が見た限り、カルパインを抑制するような論文ではやはりカルパイン阻害剤を用いていましたので、このような投稿をさせて頂きました。
カルパイン阻害剤も現在手元に無いので、EDTAで十分でしたらその方が嬉しいです。
何か参考文献等をご存知ではないでしょうか…？


capn様、TS様
> E-64-dは細胞に振りかけても効きます。

> 細胞にカルパインインヒビターを直接かけておいてサンプリングしてみるのは？
> 最終的な目的をクリアできるかどうかはわからないけど、
> とりあえずバンドが確認できるかどうかがわかるかも。

手技的な問題でサンプリングの際にプロテアーゼが活性化してしまっている可能性も十二分に考えられるので、予めブロックできるのであればそれに越したことはありません。
参考にさせて頂きます。ありがとうございます。


AP様
>[Re:3] APさんは書きました :
> PMSFってセリンプロテアーゼ以外、効くんだっけか？

参考書 (名前は忘れました…) の表にPMSFがセリン／システインプロテアーゼインヒビターと載っていたため、そのように考えていました。
メインの活性はセリンプロテアーゼで、システインプロテアーゼにはそれほど効果は無いのでしょうか？


おお様
> calpain inhibitor IとかIIIとか売って他と思うけどあとはシステインプロテアーゼインヒビターのE64とかTPCKだったかなをRocheのcomplete inhibitor coktailに混ぜて目的の蛋白の量がcomplete inhibitor 単独より二、三倍上がったという経験はあるけど、細胞内ですでに切断されているなら、プロテアーゼインヒビターをいくら加えてもきかないよ。
>
> HEK293細胞で過剰発現させたサンプルを少量そのサンプルに混ぜて切れるかとかやってみる?

やはりプロテアーゼが原因でバンドサイズが変わることもあるのですね…。
一応、基本的には切れていない状態で機能しているものなので、サンプリング前には切れていないものがほとんどだと思います。
ちなみに、E64等をさらに加えたとのことですが、カクテル中のシステインプロテアーゼインヒビターでは不十分なこともあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.4600-9 - 2015/11/18 (水) 16:37:57 - み
カルパインが問題ならLysis bufferにEDTAを入れておけば良い。

しかし、外来蛋白を認識したからと言って抗体が大丈夫とは断定できないよ。
抗体に問題がないとしても色々とハードルはある。。。
内在蛋白の発現レベルは圧倒的に低いだろう。
内在蛋白を検出するだけの腕がないのかも。

WB re-probing 削除/引用
No.4600-8 - 2015/11/18 (水) 13:07:43 - おお
ぎゃくにE-64は膜透過性が低いので細胞にかけるのに向きません。

(無題) 削除/引用
No.4600-7 - 2015/11/18 (水) 12:46:18 - capn
E-64-dは細胞に振りかけても効きます。

(無題) 削除/引用
No.4600-6 - 2015/11/18 (水) 12:35:01 - TS
細胞にカルパインインヒビターを直接かけておいてサンプリングしてみるのは？
最終的な目的をクリアできるかどうかはわからないけど、
とりあえずバンドが確認できるかどうかがわかるかも。

(無題) 削除/引用
No.4600-5 - 2015/11/18 (水) 12:08:28 - おお
>[Re:3] APさんは書きました :
> PMSFってセリンプロテアーゼ以外、効くんだっけか？

セリンプロテアーゼ阻害剤として使われはじめたけど、阻害効果は幅広く他のプロテアーゼも阻害するってwikiにかいってあったような気がします。

カルパインにはきくかなぁ。。。けっこうケミカルによる阻害は難しいらしいときいたことがある。

(無題) 削除/引用
No.4600-4 - 2015/11/18 (水) 12:03:44 - おお
あ、ただし私が見たタンパク質は何が分解しているのか定かではないです。

(無題) 削除/引用
No.4600-3 - 2015/11/18 (水) 12:02:34 - AP
PMSFってセリンプロテアーゼ以外、効くんだっけか？

(無題) 削除/引用
No.4600-2 - 2015/11/18 (水) 11:54:34 - おお
calpain inhibitor IとかIIIとか売って他と思うけどあとはシステインプロテアーゼインヒビターのE64とかTPCKだったかなをRocheのcomplete inhibitor coktailに混ぜて目的の蛋白の量がcomplete inhibitor 単独より二、三倍上がったという経験はあるけど、細胞内ですでに切断されているなら、プロテアーゼインヒビターをいくら加えてもきかないよ。

HEK293細胞で過剰発現させたサンプルを少量そのサンプルに混ぜて切れるかとかやってみる?

WBでのバンドの位置とprotease 削除/引用
No.4600-1 - 2015/11/18 (水) 11:41:48 - あぽー
いつも参考にさせて頂いています。

現在、平滑筋細胞から内因性のある膜タンパク質をWBで検出しようとしているのですが、想定されるサイズにバンドが検出されません。しかし、その半分くらいのサイズの場所にはきれいにバンドが出ています。
HEK293細胞で過剰発現させたサンプルでのWBでは、想定されるサイズにバンドが検出できていましたので、抗体は問題ないと考えています。
また、文献的にcalpainで半分くらいに切断されるとの報告がありますが、一応システインプロテアーゼ阻害剤としてPMSF、LeupeptinをLysis Bufferに加えています。

そこで質問なのですが、
@calpainを抑えたい場合、PMSF、Leupeptinに加えcalpeptinなどのcalpain阻害剤をさらに加える必要があるのでしょうか？
A他のproteaseの影響、実験条件等何か他の原因を考慮すべきところがありますか？

宜しくお願い致しますm(_ _)m
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