BioTechnicalフォーラム [パラフィン切片における免疫二重染色]

パラフィン切片における免疫二重染色

No.460-TOPIC - 2012/04/25 (水) 12:21:28 - 高山

パラフィン切片上で免疫二重染色を試みています。
以下のプロトコールで染まらなかったので、何がおかしいのかと思いご意見をお伺いしたいです。

賦活：ProKで37℃15分
一次抗体：各50倍で　一晩(4℃)：至適範囲内。
二次抗体：各200倍で　二時間　室温

賦活後、PODで処理し、スキムミルクでブロッキング後１次抗体、二次抗体と行いました。

二次抗体はアレクサフローラの488と594です。それぞれ一次抗体とはクロスしています。
なお、DABを用いた単染色でそれぞれが染まることは確認できています。

改善点はありますでしょうか？

ABC、LSABKitなどはそろっています。
二重でも、単染色でも染色されているのは確認できませんでした。
まずは、単染色から始めようと考えていますが、このプロトコールに何か抜けがあれば、あるいはここを変えるとというところを教えていただきたいです。

よろしくお願いいたします。
　

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(無題)

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No.460-5 - 2012/04/26 (木) 16:02:29 - う

つまり、

ペルオキシターゼ標識の２次抗体で処理してDABで発色すると
「特異的な」発色が見られる条件で

Alexa標識２次抗体に変えると上記の染色では見られていた染色像が
見られない。

ということでしょうか？

まず、基本的な質問からします。

ペルオキシターゼ標識２次抗体のときに、
DABを入れてからどのくらいで発色しましたでしょうか？
その発色は強いものでしょうか？

ペルオキシターゼは酵素
Alexaは蛍光色素

ペルオキシターゼは酵素で基質をどんどん処理することによって
シグナルが増強していく余地がありますが（過酸化水素添加による限界はある）、
つまり、１個の抗体から複数個の色素が生成される可能性がありますが、

蛍光色素は「抗体にコンジュゲートされた分だけだけ」しか光りまません。
つまり、エンハンスはされないということです。

その辺を考えた場合は、どうなのでしょうか？

賦活？

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No.460-4 - 2012/04/26 (木) 11:10:08 - JIn

ProKでの賦活は必須なのですか？？
他の賦活法は試しましたか？
というより、まずは抗原賦活なしで染めてみるのが定石かと。

(無題)

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No.460-3 - 2012/04/25 (水) 17:44:01 - 組織

> POD
これがペルオキシダーゼブロック処理だとしたら、蛍光染色では不要です。

DAB単染色で染まっているシグナルの特異性は確認されてますか？
非特異的染色という可能性はないでしょうか。

(無題)

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No.460-2 - 2012/04/25 (水) 16:26:31 - tkdn

> 賦活後、PODで処理し、

ここのところが具体的に何をしたのか分かりませんが、このステップは必要ですか？
染まらないというのは具体的にどのように染まらないのでしょうか？
蛍光シグナルが全く見えないのか、S/N比が低いのか、自家蛍光（もしあれば）も見えないのか。
状況によって対処は変わるかと。