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(無題) 削除/引用 No.46-12 - 2017/07/13 (木) 15:01:07 - てん トピ主は、ブリッジ問題は解決しただろうか。 このようになる場合は、コーティングで改善する場合もあればしない場合もあります。 しない場合は、解剖から見直す必要があります。 と言っても、慣れてくればスピードが上がって自然と改善するでしょう。

(無題) 削除/引用 No.46-11 - 2012/01/27 (金) 13:43:14 - すん ・ω・さん ありがとうございます！ ガラス表面がしっとりと濡れること、指標にし、トライしたいと思います。 チャンバーは、多数のサンプルを染色するのに楽だったので使用しておりましたが、 カバースリップの方が良さそうな感じですね。

(無題) 削除/引用 No.46-10 - 2012/01/27 (金) 12:04:59 - ・ω・ ついでながら、チャンバースライドがNaOHにやられるようでしたら、24穴のウェルに直径14 mm 程度の丸形カバーグラスを入れ、カバーグラスを処理、洗浄、接着因子をコートして使う手があります。カバーグラスを取り出すのに少し難儀するかもしれませんが（´・ω・｀）、ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.46-9 - 2012/01/27 (金) 11:55:13 - ・ω・ ガラス表面の1 M 水酸化ナトリウム水溶液処理時間は一時間でした。 この時間は検討を加えた上で決定したものではありません。結果オーライだったのです。もっと短時間でよいかもしれません。 ツボは処理後にガラス表面がしっとりと濡れることです。水をはじくようだとダメです。

(無題) 削除/引用 No.46-8 - 2012/01/27 (金) 09:44:15 - すん ・ω・さん ご返事遅れましてすみません。 NaOH処理で、実験を試みようと思います。 その際の処理時間ですが、洗浄ということなので、dishに加えるだけでいいのか、それとも一定時間放置しておくのでしょうか？その際の時間はどれくらいなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.46-7 - 2012/01/19 (木) 15:29:23 - ・ω・ 違いは比べたことがありません。 たしかに神経系の細胞をあつかっている文献で、ガラスをHCl etchedとか書いてある方法がありますね。 ガラス実験器具は塩酸洗浄することがあります。ガラスは酸では腐食されないためで、メスシリンダーなど、計量に使われる器具を清浄したい時によく行われる方法です。この脈絡で、培養用のガラス基質の洗浄にも使われているのだと思います。 NaOHなど強アルカリはガラスを腐食するので、計量器具の洗浄には適しませんが、油脂は強力に落とすことができます。 NaOHがチャンバースライドのプラスチックとガラスの接着剤を侵す可能性も考えられるので、予備試験は行ってください（わたしがやったのはカバーグラスの洗浄です）。

(無題) 削除/引用 No.46-6 - 2012/01/19 (木) 14:15:23 - すん ・ω・さん ありがとうございます。Lamininコートですが、一度トライしたことあります。が、突起の伸び具合は良いのですが、問題となっている凝集の改善にはなっていません。 ガラスチャンバーをNaOHで洗浄することは知らなかったので、試したいと思います。 また、少し調べたのですが、HClで洗浄することも書いてあるのですが、NaOH, HClの効果は異なるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.46-5 - 2012/01/18 (水) 11:49:54 - ・ω・ 基質がガラスの場合、通常のプラスチック培養器に比べて、PLLでコートしても神経系の細胞が接着しにくいです。 油脂が影響している可能性もあるので、1M NaOHで一度ガラス表面を処理してみてください。（チャンバースライドが薬剤に耐えない可能性もありますが）。NaOHがガラス表面に微細な傷をつけることが接着性改善の原因という考えもあります（本当かどうかわかりませんが）。 またPLLコートだけでなく、laminin, fibronectinなどの接着因子のコートも考えてはいかがでしょうか。特にlamininは神経突起の接着と伸長に強い作用をもつ生理的な因子で、生体内でも重要な役割を担っています。 PLLコートしたうえで、さらに20 ug/ml fibronectin 10 ug/ml laminin（PBSにとかして）を4℃，overnightコートで使っていました。

(無題) 削除/引用 No.46-4 - 2012/01/18 (水) 09:25:28 - すん カイさん ありがとうございます。 ＞グリアとの共生なしでは300 cells/mm^2 (=30,000 cells/cm^2)以上でないと生きないというGary Bankerの教科書からの抜粋が書いてありました。 この記述に関しては知らなかったので、教科書を再度熟読してみます。 また、共培養は知っていたのですが、最後の砦的な感じに思っていましたので、検討し始めたいと思います。 ブリッジ（糸のように引き合う）が形成する様な問題については、何か参考になるようなことはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.46-3 - 2012/01/18 (水) 06:18:50 - カイ しまった。記憶だけで書いたら間違ったこと書きました。 繊維芽細胞じゃなくて、グリアとの共生でした。 繊維芽細胞は、他の種類の初代培養の時に共生で使うやつでした。 失礼しました。 それにしても細胞数少なすぎでは？ ちょっと昔のノート確認してみたら、グリアとの共生なしでは300 cells/mm^2 (=30,000 cells/cm^2)以上でないと生きないというGary Bankerの教科書からの抜粋が書いてありました。

(無題) 削除/引用 No.46-2 - 2012/01/17 (火) 22:02:59 - カイ 細胞は一般的に互いが出す成長因子がないと元気に生きてこないですけど、神経細胞は特にセンシティブですよ。 高密度でないと生えない、少なくなると互いが凝集する、さらに少ないと生えてこないというのはそういう理由です。 繊維芽細胞と共培養するという手もあります。 簡単に言うと、ウェルの上にロウのようなもので足をつけたスライドグラスを乗せて、グラスの上に神経細胞、ウェルに繊維芽細胞を培養する。 染色等はスライドグラスの上で行うので、繊維芽細胞は入ってこない。 …という手法です。 詳しくは、Gary BankerのCulture of Nerve Cellを読んでください。バイブル的教科書です。 あと、poly-L lysineの毒性も考慮して、コーティング後はPBSでよく洗う。使うpoly-L lysineは、防腐剤などの入っていない、cell culture用のもので行う。 …とか。 以前、安いからとIHCなんかで使うpoly-L lysineを使ったら防腐剤が入っていて、いつもどおりやってるのに神経細胞全滅なんてことがありました（苦笑） cell culture testedを使うのは大事と再認識した次第です。

神経細胞初代培養コーティング方法の問題 削除/引用 No.46-1 - 2012/01/17 (火) 13:52:42 - すん 神経細胞初代培養についてお聞かせください。 現在、低密度(1-2x10^3cells/cm2)での培養に問題が生じています。この条件だとまったく神経突起を伸ばしてくれません。細胞は１日後でも死んでる様子は無いのですが。。 また、上記より高密度(0.5-1x10^4cells/cm2)での培養ですと、翌日には神経突起を伸ばして、成長しています。しかし、細胞体がdishに散らばっていた様子が、1.5日後くらいから細胞体が凝集するような様子へと変化してしまいます。この状態ですと、神経突起が凝集体から凝集体へと伸び、複数の突起が束になった状態になっています。http://okwave.jp/qa/q6633053.htmlの回答No.3にあるような「ブリッジ（糸のように引き合う）が形成」のような感じです。また、この突起の束がdishに張り付いていないのです。dishを動かすと突起の束が揺れます。 そこで、自分ではdishのコーティング方法を疑っています。 コーティングは、スライドグラスチャンバーをPLL(0.5mg/ml), 37℃, １晩で行っています。 http://okwave.jp/qa/q6633053.htmlのトピではガラスのコーティングは難しいと書いてあります。 自分の系は、シングル神経細胞（突起と細胞体の両方）でないといけません。 長々と書いてしまいましたが、皆さんのご意見をお聞かせ願います。

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