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(無題) 削除/引用 No.4593-9 - 2015/11/16 (月) 18:29:31 - 橘 de novo transcriptome assemblyのデータから生合成遺伝子を探したということですね。 seventhさんのおっしゃるように、ヒットしたコンティグのindelが入る場所は読み間違っているかもしれませんので、coverage depthを確認して下さい。 ACE,AFG,SAM,BAMとかならTablet https://ics.hutton.ac.uk/tablet/ で開けばわかると思います。 それでcoverage depthが低いようなら読み間違いかもしれませんので、翻訳せずに核酸のままアライメントしてみましょう。 読み間違いが疑われるindelは、とりあえずは1文字削るかNを足して人工的フレームシフトがなさそうな状態にしてみて下さい。 厳密な証拠が必要な場合はサンガーでそこを読み直します。 そこから先は何を議論したいのかわからないので何とも言えないですね。 ヒットしたのが酵母とか細菌の遺伝子だったら、実際にアミノ酸レベルのindelがあるのはおかしくはないですし、遺伝暗号が違う生物だとアミノ酸ではある程度似ていても核酸では全然違うので、核酸で検索したのなら他人の空似かもしれません。 ですからそういう意味でもblastxの方がいいのではとなります。 遠縁な場合はHMMERなどを使うことも検討した方が良いかもしれません。 しょーもないミスとしては、翻訳時に遺伝暗号の違いを考慮し忘れてた、といったこともあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4593-8 - 2015/11/16 (月) 18:17:18 - バンノ 皆さま本当にご親切にありがとうございます。 この植物のステロイド系の推定生合成仮説を知りたかったのですが、次世代だけではなく、サンガー法でポイントポイントは確かめるべきですよね。 参考に今後対策を練っていきます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4593-7 - 2015/11/16 (月) 15:32:23 - seventh アセンブルされた配列は一種類の塩基が連続している領域の塩基数が実際の配列とずれていることがあります。その場合ORFも途中からずれます。 なのでまずはblastxでアセンブル配列と既知の相同遺伝子のアミノ酸が1つのフレームで相同性があることを確かめたほうが良いです。アセンブル配列に次世代シーケンサーリードをマッピングしてみてINDELやSNPsがないか確かめたほうがよいかもしれません。 シークエンスやアセンブルにはエラーが生じるものなので目標の遺伝子が絞れているなら通常のサンガー法のシーケンサーでコード領域だけでも確かめたほうが良いです。

(無題) 削除/引用 No.4593-6 - 2015/11/16 (月) 14:39:55 - たていす >いくつかの配列ではGAPが多く、配列も一致しない部分が多々ある状況。 alternative splicingの可能性もあるでしょうが、別の遺伝子産物である可能性もあるのではないか？ ＞探索した既に調査された細菌・酵母・植物類の核酸の全長配列を取得して、 ＞それに対して相同検索をしている のですよね。 MEGAで特定の遺伝子にアラインするのではなく、特定の全ゲノムに対して、rna-seqのreadを張り付けていくのが正攻法ではないでしょうか？（私にはどちらも経験ありませんので悪しからず）MEGAでアラインメントはその後で使うのではないかなあ？

(無題) 削除/引用 No.4593-5 - 2015/11/16 (月) 13:50:37 - おお Blastって局所アライメントだからあまり似てないところはアライメントせずに飛ばしてしまうことが問題になってるんでしょうかね。。。

(無題) 削除/引用 No.4593-4 - 2015/11/16 (月) 12:38:39 - バンノ 橘様・おお様 おっしゃる通りです。掲示板で開示しにくい部分も多々あり、質問がざっくりして申し訳ありません。BLASTの対象は植物とまでしか言えないのですが、 活性中心がしっかりとれているようなので、BLASTの条件が緩いというのはないと考えています。 更に、イントロンは次世代シークエンスに供した際に、mRNAとして提出しており、逆転写酵素はポリA付加されたイントロンのないmRNAにしか働かないため、含まれていないと考えています。 そもそもここが間違っていたら問題なのですが・・・ プロトコルと致しましては、 �@ある植物からmRNA抽出 �A次世代シークエンス解析を委託し、アッセンブル済みのデータを取得 �BNCBIからステロイド代謝経路にかかわる生合成遺伝子を探索 �C探索した既に調査された細菌・酵母・植物類の核酸の全長配列を取得 �D相同検索 �E生合成遺伝子が何個かヒット �F核酸からアミノ酸にGenetyxで変換し、MEGA6でアライメント �Gいくつかの配列は綺麗にアライメントできたが、いくつかの配列ではGAPが多く、配列も一致しない部分が多々ある状況。 　生物種も大きく異ならないものなのですが、なぜこのような現象が起きてしまうのか不明な状況です。

(無題) 削除/引用 No.4593-3 - 2015/11/16 (月) 01:29:03 - おお ギャップってイントロン?

(無題) 削除/引用 No.4593-2 - 2015/11/15 (日) 20:29:53 - 橘 対象生物のゲノムサイズとシーケンスのライブラリ作成プロトコルやシーケンスした量、アセンブルやマッピングのプロトコルなどがわからないとアドバイスしようがないです。 また、ヒットした既知遺伝子配列の持ち主の生物種と、対象生物種の系統的距離も必要ですね。 遠縁ならきれいにアライメントできなくてもおかしくはないです。 BLASTの条件がゆるすぎて類似性の低い配列を取ってきてるだけという可能性もあるでしょう。 また、そもそもなんでアライメントが必要なのか(何のためのアライメントなのか)というところも書いた方がいいでしょう。 書けないこともあるでしょうけど、ある程度開示しないと現状では情報が不足しすぎています。

次世代シーケンスについて 削除/引用 No.4593-1 - 2015/11/15 (日) 17:40:11 - バンノ はじめまして、実験技術等とは少しズレた質問かもしれませんがご了承ください。 当方生物とは無縁の研究室なのですが、 NGS解析結果を用いて、他の生物などで既知の生合成遺伝子を検索する 作業を行っています。 そこで、BLASTで機能が既知の核酸配列と検索を掛けて、配列を入手し、 アミノ酸に翻訳後にアライメントを行ったのですがいくつかの配列で GAPが多すぎて上手くアライメントできない状態にあります。 うまくORFがとれていないのかなど考えたのですが。 遺伝子に詳しい先生がいないもので、何か思いつく理由がわかればアドバイス頂けるとありがたいです。

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