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(無題) 削除/引用 No.4586-12 - 2015/11/13 (金) 21:10:48 - pp 濃度もわからないのに十分とか不足とは言えないよ。 キットが違うので参考になりませんが、少ないよりは多い方がピークがきれいな印象はあります。 それでも、それぞれのキットで適正な濃度範囲があるので、一度精製したテンプレートの濃度を測定して、反応にまわしてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4586-11 - 2015/11/13 (金) 13:28:26 - hana Templateは0.5uL/20uLとかで十分でないかと。

(無題) 削除/引用 No.4586-10 - 2015/11/13 (金) 12:06:13 - 初心者 追記。 生データをみると、どうやらピークが出ておらずノイズを見ていたようでした。 7サンプルを解析して、1サンプルのみ何とか読めていました。 鋳型DNAが多いことは直接の原因となっていないかもしれませんが、鋳型DNAをたくさん入れるため、シークエンス反応20uLの系のうちカラムで精製したDNA（Elutionバッファーに溶解。Trisが入っており、EDTAは入っていない。）を4-9uLと大量に入れたことが原因かもしれないと思っております（EDTAによる反応阻害の可能性は除外できますが、多少なりとも不純物が混入してしまう？）。 改善できましたら、ご報告いたします。 上記に関してお気づきの点がありましたら、ご指摘いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4586-9 - 2015/11/13 (金) 11:06:28 - 初心者 たくさんの方にアドバイスをいただき、ありがとうございます。 ・PCR産物はシングルバンドであり、増幅される領域を含む欠失マウスでバンドが消失することが分かっているため、他の産物が混ざっているのは考えにくいかと思っています。 ・プライマーダイマーも少し見られましたが、カラムによって除去できるとのこと説明書に書いてありました。 ・プライマーの設計上読み始めの配列から、変異などにより複数の波形が見られるというわけではありません。 実験手順を見返すと、鋳型DNAの量がかなり過剰になっていました（本来入れるべき量の20倍量程度）。これが原因かなと考えております。 シーケンサーの結果の見方を理解できておらず、ノイズなのかシグナルが強くですぎているのか判断しかねていますが、説明書を読んではっきりさせたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4586-8 - 2015/11/13 (金) 10:25:09 - ねずみ raw dataは見てみましたか？シグナルが強すぎてシグナルが検出限界を超えていると（サチュレーションしている状態）上手くベースコールが出来ません（波形は出ているけどNがたくさん出てしまう）。その場合はinjection sec. を10とか5にすると上手く読めることが多いです。シーケンス反応をやり直さなくても、一度解析したサンプル（HiDiに融けている）をそのまま再解析に使えます（5回くらいまで再解析可能）。

(無題) 削除/引用 No.4586-7 - 2015/11/12 (木) 23:39:50 - おお >[Re:5] APさんは書きました : > >PCR productが複数種あるのでは？ > > だな。 ですね。 1.PCRがうまくいっていない。 2.副産物がある。 3.そのプライまーで増幅できる配列が複数ある。 1. PCRがうまくいってないのは条件検討が必要かも。ただし、ノンスペのバンドがあっても目的のPCR fragmentsを電気えいどうできりだせばいいばあいもある。 2. 1を読めば対処方法がわかると思います。 3. 電気えいどうで分けれるならそれでもいいとおもいます。そでなければプライまーをかえるか、プラスミドにいれて複数クローンよむ。 データーをみないと何ともいえないですが確かにノイズを見てるだけっていうのもあり得そうですね。シーケンス反応自体がうまくいってないかもデーターをよく見て確認してください。

(無題) 削除/引用 No.4586-6 - 2015/11/12 (木) 21:05:23 - pp PCR産物が複数、もしくはプライマーダイマーの影響が一番可能性が高いと思いますが、泳動して精製すれば改善されるかも。 あと、あまり考えられないけど、ノイズをピークだと思って重なっているように見えるとか（つまりシークエンスのラベルに失敗している）。 もしくは、まずありえないと思うけど、PCRと同じ条件でプライマーを2本いれているとか。

(無題) 削除/引用 No.4586-5 - 2015/11/12 (木) 18:25:19 - AP >PCR productが複数種あるのでは？ だな。 PCRプライマーのキャリーオーバーと断ずるのは早計だし、 副産物が特異的なものであろうと非特異的なものであろうと、混じってくるようではシークエンスプライマーだけ内側にずらしてもうまくいかない可能性が高い。 サンプルは純系（ホモ接合）なんだろうか。既知の配列でジノタイピングしているのか、未知のアリルの配列決定なんだろうか。 いずれにせよ、副産物ができないはずの反応であれば副産物ができないようにPCRを条件検討するべきだし、特異的な副産物が混じってくるようなら、PCR産物をクローニングして個々に読んだほうがいいんじゃないか。

(無題) 削除/引用 No.4586-4 - 2015/11/12 (木) 18:12:01 - み >[Re:3] 初心者さんは書きました : > 複数の波形が重なっており、読めておりませんでした。 PCR productが複数種あるのでは？

(無題) 削除/引用 No.4586-3 - 2015/11/12 (木) 17:32:46 - 初心者 お返事、ありがとうございます。説明不足で申し訳ありません。 複数の波形が重なっており、読めておりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4586-2 - 2015/11/12 (木) 16:27:54 - AP うまく読めていないでは、何が起こっているのかわからない。 ピークが出ないのか、弱いのか、複数の波形が重なって読み取れないのか。 プライマーに関しては、PCRで使ったのと同じもので（もちろん片側ずつ使うが）差し支えない。理想的には内側にずらしたプライマーがあればいいだろうけれど、それだけのためにプライマーを作るのは費用対効果が割りに合わない。

ゲノムDNAシークエンス 削除/引用 No.4586-1 - 2015/11/12 (木) 15:57:21 - 初心者 マウスのゲノムDNAの配列を調べたいと思っています。 PCRで増幅（400bp程度）→カラムで精製（プライマーを除去）→シークエンス反応 の流れで実験しましたが、うまく読めていませんでした。 最初のPCRで用いたプライマーを、シークエンス反応にも用いていますが、やはりもう少し内側の配列のものを用いた方が良いのでしょうか？ ABI310で自動的にピークが重なるように解析してくれないものでしょうか。 どうぞよろしくお願いいたします。

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