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細胞染色に関する２つの質問 トピック削除
No.4585-TOPIC - 2015/11/12 (木) 13:04:22 - たまごっち7
２つ質問があります！！
⒈ 細胞の表面に出ている分子を染色したいです。これまで生細胞を抗体で染めて、FACSでみましたが、蛍光顕微鏡でもみたいです。このタンパク質はゴルジにいますが、刺激で細胞膜に運ばれます。上司から細胞をdishにまいた後にPFAで固定して、膜透過処理せずに染色しろといわれました。ただ自分の経験ではPFAのみの固定でも抗体が細胞内に入っちゃう経験があります。なので上司の方法で上手くいくかなあと不安があります！自分が論文検索するとdishにまいた生細胞を４度で染色して二次抗体反応後にPFAで固定するという順序逆！！というのをみました！どちらがいいんですかねえ！

2. ある遺伝子aを細胞に導入したいんですが、そのタンパク質に特異的な抗体は売られてません！タグをつけると機能に影響するかもしれないんで、２つ戦略があります！一つ目はプラスミドを《ある遺伝子a - IRES-GFP》というプラスミドを作るということ。二つ目は今ある《ある遺伝子a》のプラスミドの他に、pEGFP-N1というEGFPが産生するようなプラスミドをトランスフェクションで共導入するというものです。どっちがいいですかねえ！！！！
　
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No.4585-4 - 2015/11/12 (木) 23:10:15 - おお
>[Re:3] たまごっち7さんは書きました :
> ということはPFAだけでは抗体は細胞の中に入らないと思っていいんですね？！どの道、コンフォーカルで見る予定なんです！！

はりりますよ。ただし大抵はよく入るように工夫しますが、しなくても入ります。みてゴルジとわかるなら染まっていてもいいんじゃないですか?っていっているだけです。

>
> ごめんなさい言葉足らずでした！！導入された細胞で、細胞の機能評価を免疫染色で明らかにしたいです！！これまでたんぱく質aにタグを付けて、そのタグの抗体で遺伝子が入った細胞を見つけてましたけど、タンパク質aが働いていないみたいなんです！そこで、全長のたんぱく質を入れようと思うんですが、iresのシステムを使うかpegfp-n1の共導入でもいいのかなと思って質問しました！！抗体は作ろうと話がでたんですが、エンドジナスが少ないことが示唆されてるので頓挫しています。

transientならどちらでもいいですけど、IRESを使う方が無難かなと思います。stableなど作るときはIRESだと確実性があがりますし。

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No.4585-3 - 2015/11/12 (木) 15:52:52 - たまごっち7
ということはPFAだけでは抗体は細胞の中に入らないと思っていいんですね？！どの道、コンフォーカルで見る予定なんです！！

ごめんなさい言葉足らずでした！！導入された細胞で、細胞の機能評価を免疫染色で明らかにしたいです！！これまでたんぱく質aにタグを付けて、そのタグの抗体で遺伝子が入った細胞を見つけてましたけど、タンパク質aが働いていないみたいなんです！そこで、全長のたんぱく質を入れようと思うんですが、iresのシステムを使うかpegfp-n1の共導入でもいいのかなと思って質問しました！！抗体は作ろうと話がでたんですが、エンドジナスが少ないことが示唆されてるので頓挫しています。

(無題) 削除/引用
No.4585-2 - 2015/11/12 (木) 13:14:41 - おお
1. ゴルジや細胞内のもの顕微鏡で認識できるなら先に固定してもいいと思うよ。

2. あなたの書いていることに自己矛盾があります。プラスミドの導入効率だけならIRESを使えばいいです。発現したい蛋白の発現量などは評価できませんけど。もうふたつ戦略がありますよ。抗体を作る。抗体をつくらせる。

細胞染色に関する２つの質問 削除/引用
No.4585-1 - 2015/11/12 (木) 13:04:22 - たまごっち7
２つ質問があります！！
⒈ 細胞の表面に出ている分子を染色したいです。これまで生細胞を抗体で染めて、FACSでみましたが、蛍光顕微鏡でもみたいです。このタンパク質はゴルジにいますが、刺激で細胞膜に運ばれます。上司から細胞をdishにまいた後にPFAで固定して、膜透過処理せずに染色しろといわれました。ただ自分の経験ではPFAのみの固定でも抗体が細胞内に入っちゃう経験があります。なので上司の方法で上手くいくかなあと不安があります！自分が論文検索するとdishにまいた生細胞を４度で染色して二次抗体反応後にPFAで固定するという順序逆！！というのをみました！どちらがいいんですかねえ！

2. ある遺伝子aを細胞に導入したいんですが、そのタンパク質に特異的な抗体は売られてません！タグをつけると機能に影響するかもしれないんで、２つ戦略があります！一つ目はプラスミドを《ある遺伝子a - IRES-GFP》というプラスミドを作るということ。二つ目は今ある《ある遺伝子a》のプラスミドの他に、pEGFP-N1というEGFPが産生するようなプラスミドをトランスフェクションで共導入するというものです。どっちがいいですかねえ！！！！
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