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(無題) 削除/引用 No.4584-9 - 2015/11/16 (月) 13:23:38 - イン yktさん ややこしくて申し訳ありません MCAでの酵素活性測定はプロテアソームが精製出来ているか確認をとるために行ったもので、細胞抽出液との反応実験には用いていません たていすさん やはりMG132が除ききれてない可能性がありますかね アドバイス通り細胞抽出液中のpoly-UbタンパクをIPしてやってみたいと思います

(無題) 削除/引用 No.4584-8 - 2015/11/15 (日) 18:28:13 - たていす PBSで洗った細胞中からMG132が除去されているとはあまり思えない。 MG132細胞抽出液ありでも合成基質の分解が100%で進行しているのであれば、OKかもしれない。 poly-UbタンパクをIPするのが良いのではないか？

(無題) 削除/引用 No.4584-6 - 2015/11/14 (土) 15:10:03 - ykt >合成基質MCAを用いて活性を測定してみたところプロテアソームの方に問題はないと考えられました 　 この実験では、細胞抽出液も加えた上でMCAとの反応を見た、ということですか？

(無題) 削除/引用 No.4584-5 - 2015/11/13 (金) 10:41:13 - イン NaOHで中性にしたものを直前に作って、それを使用したのでそういった可能性もないかと思います 条件の部分で気になっていたのですが、こういった実験を行った他の方々はどのような条件で行いましたでしょうか？論文などを探してみたのですが、細かく記載されているものが見つけられませんでした。そういった論文もしくはこういう条件で行って成功したなどありましたら教えて頂けると幸いです（ATP濃度、プロテアソーム濃度、細胞抽出液のタンパク濃度、時間、温度など）

(無題) 削除/引用 No.4584-4 - 2015/11/12 (木) 20:39:53 - 小言幸兵衛 ATPがへたってたりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.4584-3 - 2015/11/12 (木) 15:26:02 - イン PIは入れていません もしかしたらMG132が残っているのかな？とかも考えました しかし、一応細胞を回収後PBSでwashをしているので心配はないかと思うのですがMG132を完全に取り去るには他に特殊な方法があったりするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4584-2 - 2015/11/12 (木) 12:25:12 - 海外留学2年目 愚問ですが、細胞抽出液にはprotease inhibitorは入れていませんか？

プロテアソームによる細胞内タンパク分解 削除/引用 No.4584-1 - 2015/11/12 (木) 12:03:42 - イン 精製した26SプロテアソームをMG132処理をして回収した細胞抽出液と反応させて 、細胞内に溜まったポリユビキチン化タンパクの分解をウェスタンを使って見ているのですが、本来分解されているはずであるポジコンのポリユビキチン化されたタンパクのバンドが消えていませんでした そこで、精製した26Sプロテアソームに問題がある可能性を考え、合成基質MCAを用いて活性を測定してみたところプロテアソームの方に問題はないと考えられました 他に考えられることとして、反応時間や温度、プロテアソームと細胞抽出液の濃度などの条件を変えてみることなどをやってみましたが結果は変わりませんでした その他に考えられることとして何があるのかわからない状態です どなたかご教授いただけないでしょうか よろしくお願いします

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