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(無題) 削除/引用 No.4578-7 - 2015/11/11 (水) 15:16:33 - 弘法 私自身は回復培養の条件を検討したことがないので、あくまで頭で考えたコメントになりますが、「回復培養は、酵母を”元気”にさせるため」というのはそのとおりです。ただし、エレクトロポーレーション直後は細胞壁・細胞膜に損傷が生じているので、培地成分のいずれかが細胞に入ってしまうことが悪影響を及ぼすことはあり得るでしょう。回復培養の良い効果と悪い効果のいずれが勝るかは実験条件によりけりなので、いちがいにどちらが優れているとはいえないと思います。エレクトロポーレーション後にサンプルを３分割して３通りの回復培養を行ってみることを一度試してみるしかないでしょう。 また、ソルビトールは浸透圧を保って細胞壁・細胞膜に損傷を受けた酵母細胞の溶菌を防ぐためのものです。 また、エレクトロポーレーションが簡便と仰っていますが、効率を問題にしないなら（10^4程度/plasmid DNA）、LiOAcの方がよほど簡単だと思いますが。宿主株が決まっているなら、沢山作って凍らせておくこともできますし、プレートに生えているコロニーを楊枝で掻きとってそのまま形質転換に使うこともできますよ。

(無題) 削除/引用 No.4578-6 - 2015/11/11 (水) 14:40:49 - 誠 追加です。 回復培養に用いる溶液の候補としては、 ソルビトール 選択培地（アミノ酸での） 完全培地（YPD） を考えております。 とても初歩的で、稚拙な表現ですが、回復培養は、酵母を”元気”にさせるためだと思っております（違っていましたらご教授ください）。 それを考えるとYPDが最適だと思うのですが、その場合ソルビトール等の資化出来ない溶液中での回復培養は何を狙ったものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4578-5 - 2015/11/11 (水) 14:33:21 - 誠 弘法　様 ありがとうございます。 私の場合、相互作用相手をスクリーニングするためにY2Hを行なっているのではなく、相互作用相手が決まっており、Y2H体は（最悪、）１コロニーでも獲得できてしまえばいいのです。そのため簡便なエレポを採用しております。研究内容に関してはクローズな面もあるので伏せさせていただきます。質問をしておきながらすみません。 ＞プラスミドの脱落は細胞分裂に伴って起こることなので、回復培養が数時間程度のものであればその過程では起こりません。 わかりました。世代時間から、回復培養時間を決めたいと思います。 重ねて質問なのですが、ソルビトールよりも栄養培地の方が回復には適してますか？

(無題) 削除/引用 No.4578-4 - 2015/11/11 (水) 13:19:50 - 弘法 追加です。 私自身の経験では、エレクトロポーレーションはプラスミド量が少ない範囲（100ng以下）では確かに効率は悪くないのですが、two-hybrid法でライブラリーをスクリーニングする場合のように、数ugかそれ以上のプラスミドを使って形質転換体数を稼ぎたい時には使いものにならないという印象があります。この問題を解決できるような良いプロトコルをご存知でしたらご教示ください。

(無題) 削除/引用 No.4578-3 - 2015/11/11 (水) 13:11:48 - 弘法 プラスミドの脱落は細胞分裂に伴って起こることなので、回復培養が数時間程度のものであればその過程では起こりません。 私自身はエレクトロポレーションはほとんど経験ないのですが、どのくらいの効率が出ますか？広く用いられているLiOAc法で10^5強/ug library plasmidの効率が安定して出せますが、それより効率が良いということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4578-2 - 2015/11/11 (水) 12:14:47 - 誠 ＞過去に、エレポ後にソルビトールを加えて氷冷１時間をしてプレーティングしたのですが、その後に回復培養無しでプレーティングした時と結果に大差がなかったもので、現在は回復培養をしておりません。 誤解のある書き方をしました。 ソルビで回復培養をするプロトコールと、回復培養無しのプロトコールで差が見られなかった経験がある、ということです。

酵母のエレクトロポレーション 削除/引用 No.4578-1 - 2015/11/11 (水) 12:12:41 - 誠 度々お世話になっております。 現在、酵母のツーハイの作成に伴い、エレポでの形質転換を行っております。 色々なプロトコールを調べたのですが、パルスの後の回復培養に用いる溶液が、ソルビトールであったりYPDであったりと、どちらが良いのか決めかねている状態です。 エレポ後に生えないわけではないのですが、効率を上げられるなら試してみたいと思っております。 過去に、エレポ後にソルビトールを加えて氷冷１時間をしてプレーティングしたのですが、その後に回復培養無しでプレーティングした時と結果に大差がなかったもので、現在は回復培養をしておりません。 セレクションはアミノ酸の要求性でやってます。 また、酵母内のプラスミドは、その栄養要求性が必要ない培地（例えばYPD等の完全培地）で培養すると脱落するという話を聞いたことがあります。その点、YPDでの回復培養によってプラスミドの脱落の心配は無いでしょうか。 御助言、お願いいたします。

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