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(無題) 削除/引用 No.4570-16 - 2015/11/13 (金) 22:42:10 - くぁwせdrftぎゅいおp＠ CMそのままサンプルにしwesternてるなら無理と思う。分泌されるサイトカインの量はとても少ないので（それでもちゃんと仕事してるのでサイトカインはすごいわけだが）濃度半端なく低いだろうし。つまり普通の細胞内蛋白質とおなじような具合にはいかないとおもう。無血清培養で1,2日培養してからCM集めて硫安とかアミコンとかで100倍以上くらいまで濃縮すればなんとかなるかもしれないけど、分子量が小さいので回収率がよくないかも。それと他の蛋白質も濃縮されるので、非特異的シグナルも出やすくなるかもしれないし、得策かどうかはわからない。

(無題) 削除/引用 No.4570-15 - 2015/11/11 (水) 00:12:05 - おお 384 wel plateとかでELISAやっている人とかいますかね。抗体量は劇的に減らせるけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4570-14 - 2015/11/10 (火) 22:42:45 - まっくろん お金的なことで、、という話でしたが、実際、どのくらいの予算でどのくらいのサンプルをと考えられているのでしょうか？WBの方が必要な抗原特異的抗体が少なくてすむ(サンドイッチELISAと比べて)ので、その辺りでは確かに安いかもしれません。ただ、TNF-alphaなんかはいろんなところから出てて、安いメーカーとかもあるんじゃないですかね？実際にBiolegendなんかは他に比べると結構安いですし、キャンペーンでさらに40%offで買えたような気がします(回し者ではありません)。あと、データシートよりもだいぶ薄く抗体をコートしても検出できるはずなので、うまくやればそれほどコストがかからないと思いますし、実験の簡便さ、一度に測定できるサンプル数、検出感度なども総合すると、ELISAを検討する価値がある気がします。

(無題) 削除/引用 No.4570-13 - 2015/11/10 (火) 21:55:05 - TNF-α > 分泌されるということは細胞内にあるから分泌されるわけですよね。蛋白が合成されているかは細胞からのlysateでわかりますし、それで検出できたならまずは抗体はworkしないわけではないことがわかりますよね。分泌しているという事実が必要なのか、発現しているという事実が必要なのか、発現しているという事実で十分なのかその辺りもよく考えてください。 実際のところ発現量の増減の差を比較したかったので、細胞溶解液でも検討はできることがみなさんに言われて気づきました。 > CSTはRaw 264.7 のcell lysateでTNF-alphaを検出してますよ。 > http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/tnf-a-antibody/3707 > これマウスの細胞でしたっけ。マウスは糖鎖修飾がなかった気がするな、、、TNFは。。。ちょとむかしのことなので記憶違いかもしれないけど。 > > あとどれくらい分泌されているか過去の報告などから推察できるならやっときなさい。抗体によって大きな差があるけどECLなどのきっとのカタログなどをみるとなんpgまで検出とか書いてませんか?けたが大きくちがったら検出厳しいだろうなとかあるていど考察できるでしょう。 そうですね、ECL の検出感度などもタンパク質分泌量推測のために確認してみます。 こんな素人な質問に付き合ってくださりありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4570-12 - 2015/11/10 (火) 18:39:02 - おお >TNF-αの知識があまりなく、主に産生されたら上清中に分泌されるものだと思っていたのですが、TNF-αを WB で検出しようと思ったら、細胞溶解液を見るべきなのでしょうか？ 分泌されるということは細胞内にあるから分泌されるわけですよね。蛋白が合成されているかは細胞からのlysateでわかりますし、それで検出できたならまずは抗体はworkしないわけではないことがわかりますよね。分泌しているという事実が必要なのか、発現しているという事実が必要なのか、発現しているという事実で十分なのかその辺りもよく考えてください。 CSTはRaw 264.7 のcell lysateでTNF-alphaを検出してますよ。 http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/tnf-a-antibody/3707 これマウスの細胞でしたっけ。マウスは糖鎖修飾がなかった気がするな、、、TNFは。。。ちょとむかしのことなので記憶違いかもしれないけど。 あとどれくらい分泌されているか過去の報告などから推察できるならやっときなさい。抗体によって大きな差があるけどECLなどのきっとのカタログなどをみるとなんpgまで検出とか書いてませんか?けたが大きくちがったら検出厳しいだろうなとかあるていど考察できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4570-11 - 2015/11/10 (火) 18:16:50 - TNF-α > 　先行研究等から見てみて，サンプル中にはどのくらいのTNF-alphaがあると推定でいるんでしょうか？あまりに少ないようなら，免疫沈降などを用いる必要があるかもと感じます。あと，そもそもですが上清ではなく，細胞溶解液ではダメなんでしょうか？ 私自身 TNF-αを検出しようとしたことがなく、LPS で刺激したらそれで検出できる分は WB で検出できるものだと思っていたので、そもそもどれぐらい上清中にあるかは推定していませんでした。 あと、一応、細胞溶解液も調製したのでそちらも WB を行う予定です。 TNF-αの知識があまりなく、主に産生されたら上清中に分泌されるものだと思っていたのですが、TNF-αを WB で検出しようと思ったら、細胞溶解液を見るべきなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4570-10 - 2015/11/10 (火) 18:10:28 - TNF-α > FACSでできないの？ > FACS をやるとなるとセルソーターでしょうか？が必要になりますよね うちはタンパク質などを検出する機器がないので、WB で測定するしかありません。

(無題) 削除/引用 No.4570-9 - 2015/11/10 (火) 18:08:44 - TNF-α > 培養上清って血清込みですか？ > 持ち込みのBSAの量が多すぎてそれを非特異的に見てしまうことはあります。 はい、血清込みですね。 血清なしの方でも一度やってみたほうが良さそうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4570-8 - 2015/11/10 (火) 09:44:29 - おお >[Re:5] kinさんは書きました : > 培養上清って血清込みですか？ > 持ち込みのBSAの量が多すぎてそれを非特異的に見てしまうことはあります。 そうですね。私もそう思います。BSAは66kDaなのでちょっと50kDaあたりは低いかなと思った次第です。ただIgGも50強から70kDaぐらいの幅で検出されますけど。BSAはponceauで染まるほどだとおもいますし、大量にあるのでバンドも丸くなってたりしたりして、一度認識できるようになれば、WBでひっかけているかどうかわかるようになると思います。

(無題) 削除/引用 No.4570-7 - 2015/11/10 (火) 09:33:43 - まっくろん 　先行研究等から見てみて，サンプル中にはどのくらいのTNF-alphaがあると推定でいるんでしょうか？あまりに少ないようなら，免疫沈降などを用いる必要があるかもと感じます。あと，そもそもですが上清ではなく，細胞溶解液ではダメなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4570-6 - 2015/11/10 (火) 07:08:59 - TK-1 FACSでできないの？

(無題) 削除/引用 No.4570-5 - 2015/11/10 (火) 06:58:57 - kin 培養上清って血清込みですか？ 持ち込みのBSAの量が多すぎてそれを非特異的に見てしまうことはあります。

(無題) 削除/引用 No.4570-4 - 2015/11/10 (火) 00:53:25 - おお あとcell lysateでは検出できますか? また、糖鎖修飾もチェックしておいた方がいいのでは? >血清中のIgGがTNFとか非特異的に結合することなどはよくあるのでしょうか？ ないです。WBの2次抗体が異種間であってもいくらか反応性がある場合がおおいです(異種IgGで吸収されていてもECLplus以降の検出感度のたかいものではある程度引っかかってきたりします) >上清を1600gで3min遠心することで17kDaのタンパク質が沈殿してしまうことはないでしょうか？ ないでしょう。蛋白complexを沈殿させるのの20k-50kgで数時間からO/N必要です。余程何か大きなものにくっついてないとその程度の遠心では落ちてくることはないとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4570-3 - 2015/11/10 (火) 00:39:26 - TNF-α 回答ありがとうございます。 還元剤はメルカプトエタノールを使用しています。 血清中のIgGがTNFとか非特異的に結合することなどはよくあるのでしょうか？ それと、もう一つお聞きしたいことがあるのですが、 上清を1600gで3min遠心することで17kDaのタンパク質が沈殿してしまうことはないでしょうか？ ELISAは上清は遠心することないと思うのですが、WBに関しては、細胞も落とす意味も込めてやるべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4570-2 - 2015/11/10 (火) 00:20:19 - おお おそらく血清中のIgGとかをひっかけているのだと思いますが、、、 確認してください。TNFは分子間でS-S結合してますか?サンプルバッファーに還元剤が入ってますか。

western blot で TNF-αの検出 削除/引用 No.4570-1 - 2015/11/09 (月) 21:39:16 - TNF-α 普通は ELISA などで検出すると思いますが、お金的のこともあり、WB で TNF-α を検出しようとしています。 今回 3.5 cm dish で培養していた RAW264.7 細胞の回収した上清を 1600g×3 min で遠心したのちにその上清をとり、これを WB を行いました。 抗体は一次抗体、二次抗体ともに CST のものを使っています。 CST HP には可溶性 TNF-α の 17 kDa のバンドが出ているのが確認できるのですが、私の WB の結果では 50 kDa 付近にバンドがあるだけでした。 もちろん、LPS で刺激したものも含まれているのですが、それにすら 50 kDa のバンドがあるだけでした。 なぜ、可溶性 TNF-αの 17 kDa のバンドが現れないのでしょうか？ TNF-αは 51 kDa のホモ 3 量体を形成するらしいのですが、このバンドがそれなのでしょうか？ 一度 8 M urea でサンプル調製をしてもう一度 WB を行ってみようと思っています。

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