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リソソーム/オートファジー変異細胞でのレスキューについて トピック削除
No.4566-TOPIC - 2015/11/08 (日) 06:53:22 - lysosome
この度は大変お世話になります。どうぞ宜しくお願い致します。

現在ある遺伝子Xに着目し、クリスパーである遺伝子をKOした細胞を作製しました。
期待通りの表現型を得ました。詳しくは控えさせていただきますが、リソソームとオートファジーに関連した表現型です。

クリスパーのoff-target効果を否定するために一過性発現でレスキューをしようと思っています。タンパク質XのC末にmyc3タグがついており、細胞染色をするとmyc抗体で強く染まる細胞と染まらない細胞を識別できたので、myc抗体で染まった細胞の方が一過性導入された、と言えるとおもいます。

ただ、今の所表現型の回復が認められていません。

in vitro enzyme assayを行うと、C末にmyc3タグをつけたタンパク質Xでもタンパク質の酵素活性自体には影響なさそうです。実際に細胞内でどうか、ということまではこの実験からは言えませんが…

これまで一過性導入というと、DEAE-dextran（+chloroquine）法やlipofectamine2000、PEI maxを使用していますが、調べるといずれにおいてもライソゾームを破壊してしまうという働きがあるようです。chloroquineなんかはまさにライソゾームpHを上げて、機能をおかしくすることで一過性導入されたプラスミドが安定するのでしょうか。PEIにもそういった作用がありそうです。

もしかしたらそいいったtransfection試薬が、表現型の回復を見えなくさせているのではと思っています。そうだとしたらやはりウイルスを使ったアデノでの一過性発現や、レンチやレトロウイルスもしくはプラスミドの安定発現株細胞を取得することが早道かもしれません。

漠然とこう考えていますが、まわりに似たようなことをされている方がみえませんので、このような考えで問題ないのか、みなさまにお聞きしたいです。

lysosome、オートファジー関連の変異体への一過性レスキュー法として、適切にtranfection方法を選択することは重要だったりするのでしょうか？

長文、駄文で大変恐縮しておりますが、どうぞ宜しくお願い致します。
　
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No.4566-4 - 2015/11/09 (月) 14:01:35 - おお
まあウイルスや安定導入はやってみる価値があるかと思いますけど。というか安定導入株作っておけば何かと使えるんじゃないでしょうか?時間かかるし考えるより作ってしまう方がいいかもしれません。
lipofectamine等の試薬で薬剤選択か、レンチやレトロでもいいですね。
そのほかelectroporationとかmicroinjectionとかもendosomeを経由しないでしょうけど。

(無題) 削除/引用
No.4566-3 - 2015/11/08 (日) 20:32:53 - とらこ
リポフェクションやリン酸カルシウム法などは、GFP-LC3のドット形成に影響するとか聞いたことあります。

すべての一過性トランスフェクションがオートファジーに影響するかはわかりませんが、CRISPR KOのコントロールとするのであれば、安定発現株を作成した方が確実でしょう。今後の実験がやりやすくなると思います。毎回トランスフェクションしなくて済むし、一過性トランスフェクション効率が低い場合は、レスキューも低くなりますし。

おおさんが指摘しているとおり、普通の細胞でトランスフェクションによるオートファジーの影響が見られるかどうかは気になるところですね。

(無題) 削除/引用
No.4566-2 - 2015/11/08 (日) 16:25:41 - おお
ちょっと詳しくはわかりませんが、primary lysosomeというかそう言うものが、endosomeと融合したり、autophagosomeと融合したりしするとすれば、endosomeからできるlysosomeはtransfectionで影響を受けるでしょうけど、primary lysosomeは影響をうけないし、それがautophagosomeの方にいけばendosomeの影響は受けないわけだし、、、クロロキンはさすがに全部のlysosomeに影響が出るかもしれませんけど、そのほかはendosome系のlysosomeに影響が出るだけですよね、、、違うかな。まあ理屈だけでプラクティカルな考慮が全く入ってませんけど。

KOしてない細胞に、何か空ベクターをトランスフェクションしたものとしてないもので比べて、その表現系に差が出たりしますか?

発現を確認されてますけど例えばKOしてない細胞のendoの発現に匹敵するぐらい発現しているでしょうか。

リソソーム/オートファジー変異細胞でのレスキューについて 削除/引用
No.4566-1 - 2015/11/08 (日) 06:53:22 - lysosome
この度は大変お世話になります。どうぞ宜しくお願い致します。

現在ある遺伝子Xに着目し、クリスパーである遺伝子をKOした細胞を作製しました。
期待通りの表現型を得ました。詳しくは控えさせていただきますが、リソソームとオートファジーに関連した表現型です。

クリスパーのoff-target効果を否定するために一過性発現でレスキューをしようと思っています。タンパク質XのC末にmyc3タグがついており、細胞染色をするとmyc抗体で強く染まる細胞と染まらない細胞を識別できたので、myc抗体で染まった細胞の方が一過性導入された、と言えるとおもいます。

ただ、今の所表現型の回復が認められていません。

in vitro enzyme assayを行うと、C末にmyc3タグをつけたタンパク質Xでもタンパク質の酵素活性自体には影響なさそうです。実際に細胞内でどうか、ということまではこの実験からは言えませんが…

これまで一過性導入というと、DEAE-dextran（+chloroquine）法やlipofectamine2000、PEI maxを使用していますが、調べるといずれにおいてもライソゾームを破壊してしまうという働きがあるようです。chloroquineなんかはまさにライソゾームpHを上げて、機能をおかしくすることで一過性導入されたプラスミドが安定するのでしょうか。PEIにもそういった作用がありそうです。

もしかしたらそいいったtransfection試薬が、表現型の回復を見えなくさせているのではと思っています。そうだとしたらやはりウイルスを使ったアデノでの一過性発現や、レンチやレトロウイルスもしくはプラスミドの安定発現株細胞を取得することが早道かもしれません。

漠然とこう考えていますが、まわりに似たようなことをされている方がみえませんので、このような考えで問題ないのか、みなさまにお聞きしたいです。

lysosome、オートファジー関連の変異体への一過性レスキュー法として、適切にtranfection方法を選択することは重要だったりするのでしょうか？

長文、駄文で大変恐縮しておりますが、どうぞ宜しくお願い致します。
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