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(無題) 削除/引用 No.4564-6 - 2015/11/07 (土) 18:14:07 - AP 備忘 http://www.pnas.org/content/105/38/14371.full

(無題) 削除/引用 No.4564-5 - 2015/11/07 (土) 17:49:42 - AP 膜タンパク質を大腸菌の可溶画分に発現するのに成功した例ってあるのかしら？ よほど可用性の高いタンパク質と融合すれば部分的には可溶化するかもしれないけれど。基本的に真核生物の膜タンパク質を大腸菌で発現させようとすると、致死になるか、封入体に閉じ込めることで死ぬのを免れるか、だと理解しています。だからこそ、こういう研究もある（現在、これらのホスト商品化されてますね） http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228369690399X 可用性の高い大きめのタンパク質と融合したりするとごく一部可溶画分に入っているという程度で、うまくいっても大部分は封入体行きでしょう。 最近のキットのマニュアルを読んで驚いたんですが、今の市販タンパク質発現系は可溶画分に発現タンパク質がいくことしか想定してないというか、上清に溶けている分だけしか相手にしないというか、を前提として、いきなりぶっつけ本番でアフィニティ精製にもっていく方法にしか触れてないんですよね。 かつては、プレパラティブスケールに行く前に、数mLの小スケールで発現させてみて（未発言を対照において）、使用するlysis buffで溶菌した段階で、上清と不溶性沈殿をSDS-PAGEして、発現タンパク質が主にどの画分にあるかとか、誘導の条件とか検討するのがあたりまえだったんですが。 やりかたは、上清と同じ体積のlysis buffを沈殿に加えて懸濁して、等量の上清、懸濁液に対して2x smaple buffを加えて通常のSDS-PAGEすればよろしい。 沈殿はもちろんlysis buffに溶けませんので可能なかぎり均質なスラリーになれば良いです。Sample buffを入れてボイルすれば可溶化します。 あるいは、最初から沈殿を適当な体積のサンプルバッファーにとかしてもよろしい。

(無題) 削除/引用 No.4564-4 - 2015/11/07 (土) 15:11:52 - KC お二人ともありがとうございます SDSならうちにあるので、それで懸濁して電気泳動してみることにします。

(無題) 削除/引用 No.4564-3 - 2015/11/07 (土) 14:33:04 - おお 封入体はある程度定義のあるものですが、大腸菌でタンパクを強制発現して得るとき、プラクティカルには難溶性で実際の生理的な環境から得られる場合には溶けていそうな条件でも、溶出されない状況のとき封入体を形成しているだろうとたいていはいうのだと思います。たいていの場合は1% TX100のような変性作用のよわい界面活性剤をつかった場合はほとんど溶出されず、変性条件下で溶出されるものをプラクティカルにはいうのだとおもいます。 得られた沈殿をSDSや尿素など変性作用の強い可溶化剤でけんだく、溶解して調べるといいかと思います。 うーんでも膜タンパク質ですよね。大量の発現は難しいかも。。。

(無題) 削除/引用 No.4564-2 - 2015/11/07 (土) 14:28:46 - doi 電気泳動

封入体の形成を確認したいです 削除/引用 No.4564-1 - 2015/11/07 (土) 13:43:53 - KC 大腸菌BL21(DE3)やC41(DE3)などで膜タンパク質を発現し、精製を行っているのですが、なかなか目的タンパク質を得ることができません。 封入体を形成してしまっているかもしれないと思い、確認したいのです。 しかし、沈殿からどのようにしたら目的タンパク質が封入体として存在するとしていいのか分からず困っています。 どなたかアドバイスいただけると助かります。

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