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(無題) 削除/引用 No.4562-5 - 2015/11/09 (月) 22:09:27 - tana RAWデータで蛍光の増加は生じていますか？ 蛍光が増えているのに、増幅曲線が描けていないなら、蛍光色素の指定を間違えているのでは。本来SYBRを、FAMやVICとかに。うまくいった時と値を比べてみてください。 どの色素も増幅していないなら、増えていないんでしょうね。 けど、PCR後のサンプルを電気泳動して、本当にPCR産物が生じていないか確認してみては？ ピークが複数ある、というのはメルティングカーブのところだと思うんですが、これは蛍光強度がまともに増加していないからノイズ程度の変化を拾っているだけかも。メルティングカーブの強度もうまくいった時と比べてみてください。 あと、温度変化の履歴を確認して、サイクルがきちんと進行していたか確認もするべきでは。

(無題) 削除/引用 No.4562-4 - 2015/11/09 (月) 19:42:53 - biginer すべてエラーとして 指数関数的増幅領域が確認されない Threshold自動設定時に問題確認 ™ピークが複数ある の３つがいつも出ます やはり手技の問題なのでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.4562-3 - 2015/11/07 (土) 12:36:15 - 独り言 プライマーやcDNAが一日で駄目になるなんてとないです。DNAseを加えたりしない限り。 PCRの試薬も室温に放置でもしない限り、いきなり活性０になることはないでしょう。 そもそもwellでエラーが出たっていうけど、何のエラーなんでしょう？それがヒントなんではなくて。

(無題) 削除/引用 No.4562-2 - 2015/11/07 (土) 01:50:16 - おお 手技に問題がないなら、機械が壊れたんでしょう。

リアルタイムPCR 削除/引用 No.4562-1 - 2015/11/06 (金) 16:10:37 - biginer リアルタイムPCR初心者です。初歩的な質問かもしれませんがお願いします。 最近リアルタイムPCRをはじめました。ツーステップで行っており逆転写はランダムプライマーを用いています。 蛍光色素にはSYBR GREEN Master Mixを用い、PCRの機械はStep One を使っています。 ある日、実験で前日に用いたのと同じcDNA、プライマーを用いて検量線の作成をしようと思ったのですが、すべてのウェルで同じエラーが出て指数関数的増幅が見られなくなってしまいました。前日の実験では指数関数的増幅が見られ検量線もひけていましたので、プライマーの問題ではないと思います。手技に問題があるのではないかと思いやり直しもしましたが、同じ結果です。 考えられる原因はありますか。ぜひ教えてください。

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