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(無題) 削除/引用 No.4562-25 - 2015/11/25 (水) 10:29:11 - たま 追記 「StepOne でrunしてみる」は、 ・泳動で増幅産物が確認された ・qPCR用の試薬を用いた ものに限ります。

(無題) 削除/引用 No.4562-24 - 2015/11/25 (水) 10:26:44 - たま > > サイクルを回してもバンドが出ないということは増幅部分が疑わしいので通常のサーマルサイクラーでqPCR試薬を使ってバンドを確認してみてはどうですか？ > > 試薬の方を疑うならqPCR用のプライマーとcDNAと別のtaq（qPCR用でなくてもOK）で使ってみて下さい。 > わかりました。やってみようと思います。 とにかくこれ。機械のことは後回し。 一部泳動した後に、そのままStepOneに入れてrunしてみよう。（qPCR用のチューブで） もちろん増幅はしないけど、（し終わってるから）melt curveがとれるかで検出系の疑いが少しは明らかになる。 なお、SYBRがーになるのは、「バックグラウンドより低かった」という意味。

(無題) 削除/引用 No.4562-23 - 2015/11/25 (水) 00:09:27 - おお マシンが壊れていることをなぜ疑わないのか、、、

(無題) 削除/引用 No.4562-22 - 2015/11/24 (火) 23:53:09 - 名無し >メンテナンスもしてみましたが問題ありませんでした。。 これはStepOneのCalibration kitを購入して、おこなったということでしょうか？ Kitも安くはありませんし、それでも問題が発生しているのなら、さすがにサービスを呼んだ方がいいとは思いますが、、 別のラボや共通機器に他のマシンがあるようでしたら、そこで問題のあるcDNAや試薬を試してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4562-21 - 2015/11/24 (火) 18:30:18 - biginer ROXとSYBRのデータを見ていて疑問に感じたのですがSYBRがマイナスの値をとるのはなぜなのでしょうか？ cDNAが入っていなかったりする箇所が0になるのはわかるのですが負になる理由がわかりません。。

(無題) 削除/引用 No.4562-20 - 2015/11/24 (火) 18:20:47 - biginer seventhさん > 酵素はPCR試薬の中では一番不安定ですが、ピペッティングで失活するほど弱くはないです。 お恥ずかしい話なんですが、はじめは泡立ててしまったり混ざってるか不安で50回くらいピペッティングしてしまっていたんですがそれは問題ないのでしょうか？ > サイクルを回してもバンドが出ないということは増幅部分が疑わしいので通常のサーマルサイクラーでqPCR試薬を使ってバンドを確認してみてはどうですか？ > 試薬の方を疑うならqPCR用のプライマーとcDNAと別のtaq（qPCR用でなくてもOK）で使ってみて下さい。 わかりました。やってみようと思います。 > 機器の異常を疑うならメンテナンスのマニュアルを確認してください。 メンテナンスもしてみましたが問題ありませんでした。。 >おおさんは書きました : > 機械の検出系のことを言っているんだと思いますよ。私も機械の検出系を疑ってます。 Quantitation Relative Standard Curveで設定して行っています。 あとSYBR Greenのスタンダードモードで行っています。 これだと実験系の説明ですか？

(無題) 削除/引用 No.4562-19 - 2015/11/24 (火) 10:20:11 - seventh 酵素はPCR試薬の中では一番不安定ですが、ピペッティングで失活するほど弱くはないです。 サイクルを回してもバンドが出ないということは増幅部分が疑わしいので通常のサーマルサイクラーでqPCR試薬を使ってバンドを確認してみてはどうですか？ 試薬の方を疑うならqPCR用のプライマーとcDNAと別のtaq（qPCR用でなくてもOK）で使ってみて下さい。 まずはどこが正しいか確認しないと闇雲に実験を繰り返すことになります。 機器の異常を疑うならメンテナンスのマニュアルを確認してください。 自分でわからないようなら業者に聞くしかないですね。

(無題) 削除/引用 No.4562-18 - 2015/11/23 (月) 15:45:37 - おお 機械の検出系のことを言っているんだと思いますよ。私も機械の検出系を疑ってます。

(無題) 削除/引用 No.4562-17 - 2015/11/23 (月) 15:33:45 - biginer >AAさん プレートやチューブはかわっていません。 初心者のためかなり念入りにピペッティングをしていたのですが、色々調べたところPCR酵素が非常にデリケートでピペッティングしすぎると壊れてしまうとわかりました。このせいで検出系がだめになっているかもしれないので、試してみようと思っています。 >おおさん ベルチェは働いていると思います。自己診断してくれるかはわかりませんが。。 >tanaさん 何回か前にうまくいった時のcDNAを用いてやってみましたが、だめでした。 サイクル数は40サイクルまわしていて十分だとは思います。立ち上がってからやめたりはしていません。 みなさん様々なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4562-16 - 2015/11/21 (土) 11:26:42 - AA なんとなく検出系がダメになっている気がしますが・・・ あるいは、最近プレートやチューブのロットがわかったりしていないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4562-15 - 2015/11/21 (土) 00:21:04 - おお ペルチェが働いてないか検出系に問題があるのでは？お使いのものは自己診断する機種なんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.4562-14 - 2015/11/20 (金) 20:08:21 - tana とりあえず、サイクルは正常に行われて（温度履歴）、 ゲル電気泳動してもPCR産物は確認できず、 色素の値の変化も見れないなら、やはりテンプレートか 他の試薬に問題があってPCRができていないのでしょうね。 何かポジコンはないですか？ うまくいった時のサンプルは残ってないですか？ あれば、それを1000倍程度に希釈して再度マスターミックスと プライマーを加えてPCRしてみる。 または、購入したkitとかについてきたコントロールのcDNAとプライマーとか。 それか購入したベクターと添付のプライマーとか。 この実験で増えれば（蛍光の増加があれば）、マスターミックスに問題は無く、 プライマーかtemplateがおかしいのでしょう。 増えなければ、PCR後のサンプルを泳動してみて バンドがあるなら、Steponeの検出部に異常があるのかも。 というか、サイクル数は充分なのでしょうか？ ちょうど蛍光が立ち上がるあたりでやめちゃってたり しません？ 念のため50cycleまでやってみるとか。 これで増えれば、ただ単純にcDNAが分解してた可能性が高いと 思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.4562-13 - 2015/11/19 (木) 11:09:57 - biginer ROXデータの確認ができました。 成功データと比べて一直線ではなく小さく波打ったようになっていて一定値をとっていませんでした。おおまかな値については成功データとあまり変わりありません。 SYBR色素の値については失敗データがマイナスの値をとっていました。 原因についてさらに調べてみます。ご存知のことがあればぜひ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4562-12 - 2015/11/19 (木) 10:51:21 - biginer 以前成功したときデータと見比べようと再度確認したところRAWデータに違いが見られました。 成功したときはRAWデータが小さい角度で緩く直線的に増大していっていたのですが、失敗データは急な角度で増大が見られました。色素の選択のミスはありませんでした。 一度分解してしまっているmRNAで逆転写したcDNAを間違って用いてしまったのですが、そのときでも緩い増大しか見られませんでした。 前回の記述と矛盾してしまい申し訳ないのですが、確認する箇所を間違えてしまっていたようです。すみません。

(無題) 削除/引用 No.4562-11 - 2015/11/19 (木) 10:45:37 - biginer おおさん > ほかにその機械で実験している人いませんか?その人が使うときにあなたが用意したreaction mixを同時に乗せてもらったらどうですか? 他にその機械で実験している人はいません・・ > どうしても解決しないなら、カスタマーサービスとかに電話して、機械のことならチェックポイントを提示してくれればそこをクリアーしていれば機械としてワークしているだろうということで修理は必要かはわかるし、初心者がやりそうな失敗例なども教えてくれるかもしれません。 > 同時にあなたの使っているマシーンはなんでしょうか?それを開示すればもう少し具体的な話は出てくるかもしれません。 Step Oneの48ウェルです。 AAさん > ROXなどのリファレンス色素のデータはどうなのでしょうか？ リファレンス色素にROXが含まれているのですが、ROXのデータを確認するタブが解析ページにないのかわかりません・・初心者ですので理解が浅いですねすみません・・

(無題) 削除/引用 No.4562-10 - 2015/11/18 (水) 02:57:02 - おお ほかにその機械で実験している人いませんか?その人が使うときにあなたが用意したreaction mixを同時に乗せてもらったらどうですか? どうしても解決しないなら、カスタマーサービスとかに電話して、機械のことならチェックポイントを提示してくれればそこをクリアーしていれば機械としてワークしているだろうということで修理は必要かはわかるし、初心者がやりそうな失敗例なども教えてくれるかもしれません。 同時にあなたの使っているマシーンはなんでしょうか?それを開示すればもう少し具体的な話は出てくるかもしれません。 具体的な話が全くないので、手技が悪いのでしょうかといわれても誰も答えられませんよ。ROXに関しても何もコメントが帰ってこないですし。。。

(無題) 削除/引用 No.4562-9 - 2015/11/17 (火) 18:53:14 - biginer ゲル電気泳動をやってみました。 やってみたところ目的の箇所にバンドは出ませんでした。 ということはやはり、私の手技の問題なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4562-8 - 2015/11/16 (月) 17:12:13 - AA ROXなどのリファレンス色素のデータはどうなのでしょうか？

以前あった事例 削除/引用 No.4562-7 - 2015/11/16 (月) 16:03:05 - ご参考までに ABIの古い機種でランプが切れてたのに気づかずに無駄にトラブルシューティングしてた事があった。突然増幅曲線が出なくなりあれこれ確かめたあげく本体からいつもの光線漏れがないのに気づいて脱力した。ランプが切れたら黙ってないでなんか言え＞ABI PRISM 7000

(無題) 削除/引用 No.4562-6 - 2015/11/14 (土) 11:56:57 - biginer RAWデータで蛍光の増加はみられません。 蛍光の種類の設定にミスがないかということや温度の確認もしています。 ゲルでの確認は行っていないので試してみます。

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