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(無題) 削除/引用 No.4556-25 - 2016/02/29 (月) 19:12:38 - 質問主 おおさん 有難うございました。 このCorningの製品は使っていないので検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4556-24 - 2016/02/29 (月) 01:09:35 - おお https://www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-006.pdf Corning Primaria™ Surface The Corning Primaria surface features a unique mixture of oxygen-containing (negatively charged) and nitrogen-containing (positively charged) functional groups on the polystyrene surface. The surface supports the growth of cells that can exhibit poor attachment or limited differentiation potential when cultured on traditional TC surfaces, including neuronal, primary, endothelial, and tumor cells. The surface consistency of each lot is confirmed by electron spectroscopy chemical analysis (ESCA). Corning CellBIND® Surface The Corning CellBIND surface features a net negative surface charge due to oxygen-containing functional groups incorporated in the polystyrene surface. The surface is more hydrophilic, and thus more wettable, compared to standard TC surfaces, which facilitates cell attachment and spreading. 各社同じようなものを出してたと思いますが、、、ファルコンはなかったかもしれません。大昔だけどファルコンのディシュでロット不良か何かで出荷が滞って納期がずれ込んだ事がありましたね。

(無題) 削除/引用 No.4556-23 - 2016/02/28 (日) 22:30:25 - 質問主 おおさん DNAはQiagenのカラムで精製しています。 Falcon(Corning)のTissue culture plateを主に使っていましたが 「表面加工でネガティブとポジティブ電荷両方持つ加工」というのはどんなものでしょうか？ このtransfectionするとはがれるという問題ですが、頻度は低いですが、問題が起こり始めると（同様の実験で）何回か続けて起こるという印象で、加工処理不良のplateが出荷時にかたまっている（要するに工場での加工処理過程が一時的に不調になる）のでは、と思っています。 transfectionすると起こりやすいですが、2015-11-5 TACSさんの投稿のように、transfectionと関係なく、たまに最初からwellの中の一部分だけ接着しないということもあります。

(無題) 削除/引用 No.4556-22 - 2016/02/28 (日) 13:50:32 - おお DNAはどのように調製したものを使っているのでしょうか。最近は大抵のメーカーで、表面加工でネガティブとポジティブ電荷両方持つ加工をしてより細胞がつきやすいものもうっています。剥がれやすい細胞でトランスフェクションなどする場合はそういうプレートやディッシュを使ってもいいのかもしれません。そういうのならわざわざ前もってコーティングとかやらないでもいいし（コーティングしたものをうってたりしますけどね）。

(無題) 削除/引用 No.4556-21 - 2016/02/24 (水) 09:16:18 - 結構悩んでいます ほんじょうさん 小言幸兵衛さん ももじろうさん 細胞は、主にヒト（上皮性）がん細胞を扱い、その時に起こるトラブルです。 COS7 Hek293, 293T等も扱う事はあります。 無血清培地だと確かにそういうことは起こりそうですが、通常のtransfection (FuGene系、Lipofectamine系)ですので、plateを水平に置き、血清入の通常の培養液に、transfection試薬を添加するだけです。 通常の培養での「はがれやすさ」という点では 293T>>HEK293>COS7という順かと思いますが、主に扱うヒト（上皮性）がん細胞は、COS7と同様にしっかり接着している感触です。 293Tは元々はがれやすいので、ECMでcoatingしてtransfectionしています。 poly-D-lysine, poly-L-lysine coatingは使用したことは無いですが、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4556-20 - 2016/02/24 (水) 01:49:35 - ももじろう 扱っている細胞の種類はなんでしょう？ COS7, HEK293などをリポフェクションで扱ったことがありますが、そこまで自然に剥がれてくるようなことは経験なかったです。 いっそのこと、poly-D-lysine, poly-L-lysineなどでコーティングしてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4556-19 - 2016/02/23 (火) 22:07:27 - 小言幸兵衛 うちのラボの新人が、上清をアスピレーションするときに傾けたプレートの上半分が乾いてしまって、きれいな三日月模様をしばらく作っていたことがありました。通常の培地交換では起こらないから手技の問題ではないと思っていたようでしたが、トランスフェクション時に無血清の培地を使うせいで液切れが良いのが原因だと後に判明しました。 まさかとは思いますが、そういうこともあったということで。

(無題) 削除/引用 No.4556-18 - 2016/02/23 (火) 21:36:25 - ほんじょう っていうか 細胞は何？？ なぜ誰も聞かないの？

(無題) 削除/引用 No.4556-17 - 2016/02/19 (金) 14:45:33 - 結構悩んでいます Tokioさん 主に24 well plateを使っています。 Multiwell plateでは振動で細胞が剥がれやすい、というのは興味深いですが、 一応前日に細胞を撒き、当日細胞接着を確認してtransfectionしています。 それで、翌日見ると一部のwellで細胞が剥がれるという状態です。 たとえばMTT 等でwell内細胞数をざっと測定してしまうときは、あらかじめ全部のwellの細胞の状態を見ないと心配ですよね。

(無題) 削除/引用 No.4556-16 - 2016/02/19 (金) 13:03:48 - TOKIO 何well plateでしょうか？ 12ウェルまたはそれ24ウェル以上で細胞を播いて、勢い良くインキュベーターを閉めるとその振動でメディウムが動いて、細胞が偏る経験をしたことがあります。（おおさんが書き込まれているように。） トランスフェクション前からはがれている、または調子がおかしいですか？

有難うございます。 削除/引用 No.4556-15 - 2016/02/19 (金) 10:33:47 - 結構悩んでいます hiroさん、ご投稿有難うございました。私の経験と同様のご経験と思います。 Transfectionするので、当然細胞にある程度のdamageがあるのですが、 おなじtransfection操作をしても、（ある程度damageがあるにしろ）細胞がしっかり生着し続けるwellと、細胞が完全に剥がれてしまうwell（しかもそのはがれた領域が限局していてはっきりした輪郭がみえる）があるのが不思議で、coatingのばらつきがあるとしか思えません。 メーカーにクレームを入れましたが、結局メーカーは、「通常条件化で細胞が培養できる」ということを保証しているだけで、「Transfectionに使用できる」ということを保証しているわけではないので、全然話になりませんでした。 結局今は、transfection効率が下がるのを覚悟で、transfection条件を緩くしており、「細胞が剥がれる現象」の頻度は下がっている印象です。

似たような経験があります 削除/引用 No.4556-14 - 2016/02/18 (木) 18:46:42 - hiro PDLコートの96ウェルプレートに細胞をまいてトランスフェクションし、 薬剤を添加して・・・という実験をしていましたが、似たような経験ありです。 トランスフェクション後、薬剤を添加してオーバーナイトでインキュベートすると、 例えば、全く同じ処理を行った4ウェルにおいて、普通に接着しているウェルと 部分的にシート状にはがれているウェルがある、といった具合です。 はがれずに残った細胞は、無傷のウェルと同様の良好な状態でした。 薬剤添加直後に観察した時はどのウェルの様子も同じような感じでした。 また、薬剤に細胞毒性があった場合は、4ウェル全てで同様にはがれていました。 この現象は使用するPDLコートプレートのロットを変えてから頻繁に起こるけようになりました。 おそらく、コートの出来にばらつきがあって、トランスフェクションや薬剤など 細胞への負荷が大きくなると症状として出てくるのかな、と考えていました。 メーカーに苦情を入れようと思っていたのですが、結局その実験は終了になってしまって、 うちのラボではうやむやのままに（＾＾；）

(無題) 削除/引用 No.4556-13 - 2015/11/06 (金) 09:31:34 - 結構悩んでいます 質問主です。いろいろご回答有難うございました。 対処法として、出来るだけ端のwellは使用しないようにしています。 TACSさん、興味深いご回答有難うございました。 「細胞を播種した際にウェルの半分だけ細胞が貼りつかなくなったり、変な模様を描くようにして接着することは経験しています。」 ＝＞私も形状は、上を向いた三日月状だったり、横を底辺とする三角形状だったり、（吸引部位と関係なく）斑点状だったりと色々です。 「プレートの端のウェルに限定されず、色々な位置のウェルで起り、ウェルの上だったり右だったり場合により細胞が貼りつかない場所や面積は違います。」 ＝＞必ずしも最下段、最左右段だけではないですが、真ん中付近は起こりにくと思っています。 「稀に1プレートの大半のウェルが変な張り付き方になることがあり、そのような場合は細胞が貼りつかないエリア（右とか上とか）は全てのウェルでだいたい同じです。」 ＝＞すごいですね、メーカーに文句を言われなかったのでしょうか？ 「複数の細胞、複数の培養室、複数のインキュベーター、複数のドロッパー、複数の実験者で似たような現象が見られています。頻度は非常に低く数千ウェルに1ウェルか、それ以下です。播種した後には綺麗に接着していても、培地交換や化合物添加などの操作をした後に特定の場所が剥がれることはよくあります。」 ＝＞基本的にmulti-well plateに撒くのはtransfectionするために撒くことが多いので、transfection試薬は怪しいと思っていますが、Controlの試薬無しでも剥がれることがあり、結局はtissue-culture-treatmantのムラ・不良かと思っています。工業製品なので一定の頻度の不良品は仕方ないかもしれません。メーカーに聞くと、今は同じ製品をアジアを中心にいろんな国の工場で作っていて、品質管理とか実際は難しい面があるようです。 もうすこし、皆さんの御経験をお聞きしたいです。

(無題) 削除/引用 No.4556-12 - 2015/11/06 (金) 00:27:42 - おお 細胞の接着むらはincubatorが振動していていつも同じようなパターンが見られるっていう経験をした人がいるようですが、、、

(無題) 削除/引用 No.4556-11 - 2015/11/05 (木) 20:18:30 - TACS #1に関して トランスフェクションとは関係なく、細胞を播種した際にウェルの半分だけ細胞が貼りつかなくなったり、変な模様を描くようにして接着することは経験しています。 プレートの端のウェルに限定されず、色々な位置のウェルで起り、ウェルの上だったり右だったり場合により細胞が貼りつかない場所や面積は違います。 複数の細胞、複数の培養室、複数のインキュベーター、複数のドロッパー、複数の実験者で似たような現象が見られています。 頻度は非常に低く数千ウェルに1ウェルか、それ以下です。 稀に1プレートの大半のウェルが変な張り付き方になることがあり、そのような場合は細胞が貼りつかないエリア（右とか上とか）は全てのウェルでだいたい同じです。 播種した後には綺麗に接着していても、培地交換や化合物添加などの操作をした後に特定の場所が剥がれることはよくあります。

(無題) 削除/引用 No.4556-10 - 2015/11/05 (木) 14:35:12 - おお ちょっとたかいかもしれんけどTPP culture dishesっていうのがあって、シグマも扱っているようだけど。dishのふちには細胞が接着しないようにしているらしく、さらに表面加工もたしか、ほかのdishより平らになるようにしているとかで、細胞もよくくっつく感覚がありますが、使ってみます? TPP tissue culture dishes http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z707694?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1

(無題) 削除/引用 No.4556-9 - 2015/11/05 (木) 12:59:26 - 結構悩んでいます 質問主です。ご回答有難うございました。 端っこに起こるというのは、処理のムラが起き易いだけでなく、培養器内の悪環境の影響を受けやすい所という可能性も確かにあると思います。 ただ一応、CO2 incubatorは問題なく維持されています。 プレートをひっくり返すのは手ではありますので、やって見ますが、頻度が低いのですぐには分からないかもしれません。（ドアに対して縦置きしているので、左右をひっくり返すことになります。） でもスクラッチしたようにはっきりした境界を作って剥がれるので、種々の悪環境の影響とか操作の不良とか考えにくいのではと思うのですが 私も十年以上ヒトの培養細胞を使って研究していますが、去年初めて気がつきました。もともと、Multi-well plateの場合、wellをいくつかランダムに見て、全部は見ていなかったのがいけないのですが。 ずっとLife Techやpromegaなど大手の試薬を使っていますが、新しい高効率のtransfection試薬がどんどん出てきているのも原因かなあとは思っています。 とにかく、比較的稀な現象なので、もう少し、時間をかけてお聞きしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4556-8 - 2015/11/05 (木) 12:53:24 - うぇる マルチウェルプレートの場合、一番外側のウェルは外部の影響を受けやすいので極力使わないようにしたほうがよいかもしれません。 日本だと部屋自体の湿度が高いので問題ないですが、海外の乾燥した地域だとインキュベーターの湿度をちゃんと維持していても、外側のウェルの溶液がどんどん蒸発していくことがよくあります。 そのせいで、結果にバラツキもでてしまいます。 そのため、内側だけを使うか、さらに外側のウェルにPBSか滅菌水を入れたりして培地の蒸発を防いだりしています。 今回、ウェルのなかでもさらに外側のみということですけど、インキュベーターのファンは問題なく機能していますか？ マルチウェルプレートの隙間から空気が循環します。循環がおかしいと外側から影響がでるように思います。 いずれにしても、実験上支障がなければ、内側だけ使うことをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.4556-7 - 2015/11/05 (木) 12:52:08 - サンショウウオ 培地をアスピレーターで勢い良く吸って、その時に剥がれているだけな気がする。 右利きであるなら、 最左段（列？）のwellを吸うとき、左側の底部にアスピレーター先端を押し付けて勢い良く吸っていれば左側は剥がれそうですね。 　同様に、最下段のwellの培地を吸うとき、well下側の底部にアスピレーター先端を押し付けて勢い良く吸っていれば下側の細胞は巻き込まれて剥がれそうですねぇ。。。 　アスピレーターで吸う前と、吸った直後に細胞が剥がれているかどうか見てください。トランスフェクションは関係ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4556-6 - 2015/11/05 (木) 12:41:10 - mon 工業製品なのである頻度で不具合が含まれているとは思います。 しかし、メーカーを変えても起こること、境界がハッキリしていること（表面処理の工程からは考えづらい）から、手技の問題が疑われます。 例えば、培地を吸引する際にplateを傾けたときに細胞が乾燥したとか。 手順を変えてみてはいかがでしょうか？6well plateなら横二列ではなく縦三行の順で作業するとか。あるいは、（乾燥しない状況で）横一列ずつ作業を完結して残りの一列を行うとか。

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