たくさんのコメント、ありがとうございます。
APさん、
ノックアウト組織での抗体前吸収は、いい案だと思います。
アセトンパウダーで組織を準備したあと、どれぐらいの量を抗体に混ぜるかは試行錯誤するしかないのでしょうか。
私が考えていた抗体前吸収の方法は、ノックアウト組織でlysateを作成してからfinal protein lysate 100ug/ml, antibody 5ug/mlでovernight icubation。それをウエスタンの一次抗体として今週トライしようと思っていました。
おおさん、
抗体濃度は、1:100, 1:500, 1:1000と段階的に希釈したのみで、最終的には1:500で使用しています。もう少し薄めの濃度で条件を振ってみたいと思います。
bufferもいろいろなのを試してみたいと思います。
みさん、
cell lineでも試しています。正常細胞、がん細胞（これらの細胞では発現量がかなり少ないです）、このたんぱく発現が多い細胞と試しました。siRNAも3つ試しましたが、overexpressionしたものをknockdownはできるのですが、endogeneous expressionはやはりnonspecific bandが重なるため、knockdownをたんぱくレベルでは確認できていません。qPCRでは確認できるのですが。
独り言さん、emaさん
そうです、WTとKOで差が出やすそうな組織でimmunofluorescenceで確認したのですが、WTとKOでの染色の差を証明するのは現状では大変そうです。 |
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