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(無題) 削除/引用 No.4546-7 - 2015/11/01 (日) 15:22:53 - mon リコンビナントタンパクなしで、HRP-anti-myc(TBS-Tで希釈）で希釈で問題無いなら、リコンビナントタンパクがtotal cell lysateのブロットに非特異的に結合している可能性が高いと判断出来ますね。 リコンビナントタンパクの濃度を下げる(1/5,1/25くらいで様子見）、メンブレンの材質を変える、blocking剤を変える、Tween20濃度を上げる(0.1%)、それでも改善されないようなら、TritonX100を加える(0.1%)、塩濃度を上げる（x1.5,x2くらいで様子見)、とかでしょうか。 ＞Mycタグ付きリコンビナントの希釈は1% BSA in TBS-T 0.01-0.1%BSAくらいで十分だと思います。BSAが濃いと結合が平衡になるまで時間がかかると思います。

(無題) 削除/引用 No.4546-6 - 2015/11/01 (日) 10:04:51 - mon すいません。文末に「サンプルはWTと糖鎖を完全に欠く細胞から抽出したtotal cell lysate」と記載されていますので、far-westernですね。勘違いしていました。投稿を削除しお詫びします。

(無題) 削除/引用 No.4546-4 - 2015/11/01 (日) 08:24:42 - おお far-westernをやっているのだと思いますが、つうじょうのwbでもバックが出るときは抗体の濃度をいじるのが常套手段かと思います。 まずバックグランドになるあなたの使ったmyc-tagged proteinが原因か、anti-myc-HRPが原因かという意味では、anti-myc-HRPがほかの系でワークしているようなので、あなたのrecombinant proteinの量を減らしたりして非特異な結合が起こらない濃度を探ってみるといいでしょう。 それでもいい条件が見つからないなら、recombinant proteinとmembraneをincubationするbufferを工夫すればいいかと思います。デタージェントをTX-100 0.1-1%ぐらい加えるとか、塩濃度をあげるとか工夫できると思います。far-westernでなく IPで結合を見ている実験があるなら、その条件を参考にしたらいいかとおもいます。anti-myc-HRPのところはあまりいじらない方がいいと思います。 >いつも行っているactinやERK, paxillinなどのwesternで用いるskim milkでHRP-anti-mycを希釈すると綺麗にバックや非特異的なバンドが無くなり、endogenous mycが出てくれます。が、肝心のリコンビナントが結合したというデータが得られていません。 endogenous mycとかちょっと今イチ理解ができませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.4546-2 - 2015/10/31 (土) 15:26:37 - CC+B 追記させてください。すみません。 共同研究者がanti-myc (9E10)を何のbufferで希釈しているかはわかりませんが、HRP-anti-mouseは TBS-Tだけのようです。ちなみにMycタグ付きリコンビナントの希釈は1% BSA in TBS-Tです。 skim milk中にはlactoseが豊富にあるでしょうが、この組換え受容体はlactoseは認識しません。

HRP-anti-myc (9E10)の希釈液について 削除/引用 No.4546-1 - 2015/10/31 (土) 15:21:51 - CC+B 宜しくお願いします。 Mycタグの付いたリコンビナントタンパク質を一次抗体代わりに用い、二次抗体としてHRP-anti-myc (9E10, サンタクルズ社, 1000倍希釈) でwestern blottingを行っています。 リコンビナントは共同研究者から貰ったもので、彼らも9E10での検出を勧めています。ただ彼らはリコンビナントでニトロセルロース膜と反応後、anti-myc (9E10)を二次抗体に、さらに三次抗体としてHRP-anti-mouse IgGで行っているようです。 私はボスの意向からHRP-anti-myc（9E10）を購入して、それで westernを行っています。 共同研究者らはHRP付きの抗体をTBS-Tで希釈するようにと指示がありました。 しかしHRP-anti-myc (9E10)でブロットするとバックが大変高くなり、また、非特異的なバンドも多く見られました。いつも行っているactinやERK, paxillinなどのwesternで用いるskim milkでHRP-anti-mycを希釈すると綺麗にバックや非特異的なバンドが無くなり、endogenous mycが出てくれます。が、肝心のリコンビナントが結合したというデータが得られていません。 サンプルはリコンビナントがたくさん結合するはずのものと、全く結合しないはずのものをコントロールに用いていますが、今の所両者に差はなしです。TBS-Tでの希釈でなぜこれほどbackが高く、非特異bandsも出てしまうのか困っています。解決策はありませんでしょうか？ ちなみに、リコンビナントはある糖鎖を認識する受容体です。サンプルはWTと糖鎖を完全に欠く細胞から抽出したtotal cell lysateで、自分の他の実験からも糖鎖を完全に欠く細胞とWTの細胞間で明瞭に糖鎖の有無が分かれています。これをどうにか組換え受容体を用いたwesternでも示したいです。この組換え受容体はwesternに最適だと多くの論文があります。共同研究者（ドイツ）に聞けばいいのですが、その前にできることはないかと考えている所です。 もし気になる点やsuggestions等ありましたら、どうか宜しくお願い致します。

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