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In vitro transcription後のRNAの分解 トピック削除
No.4539-TOPIC - 2015/10/29 (木) 21:55:43 - ISHer
In situ hybridization に用いるDIGラベルRNAプローブを作成していますが、転写後のRNAを電気電気泳動すると低分子側にスメアを引いており、分解が疑われております。
流れは以下の通りです。

・マウス尻尾からのフェノクロ・エタ沈によるDNA精製
・QIAquick Gel Extraction KitとZymo社Zyppyカラムによるゲル精製（泳動バッファーは新しいものに入れ替えている）
・T7プロモーター付のプライマーによるPCR
・PCR産物をテンプレートにしてロシュのT7ポリメラーゼによるIn vitro transcription
・変性ゲル、熱変性させたサンプルを用いて電気泳動

以前にこの手順で同じ同プライマーによるISHまで成功しております。
問題点はロシュから提供されるコントロールDNAを転写するとシングルバンドでRNAを確認できますが、PCR産物はスメアを引いていることです。（CTRLはうまくいっているので転写、RNA電気泳動は問題なさそう）

転写以前のRNAaseコンタミを疑っており、テンプレートDNAを別の動物にしたり、DNA泳動バッファーを新しくしたりゲル精製をZymoのキットを使うなどしましたが、依然としてRNAはスメアを引いています。

PCR試薬はジェノタイピングに用いるものと共有しておりますので、まずはそれらを一新して再度PCRからやり直そうと考えております。

同様の経験をお持ちの方や、何かお気づきの方はアドバイスよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.4539-8 - 2015/11/10 (火) 16:31:11 - おお
うまくいってよかったと思いますが、RNaseのコンタミですか、、、なんか納得いかないのです。。。

In vitro transcription後のRNAの分解 削除/引用
No.4539-7 - 2015/11/10 (火) 16:17:29 - ISHer
昨日PCR試薬を新調したところ、RNAプローブのスメアがなくなりシングルバンドで確認できました。ジェノタイピングなどと共有のPCR試薬にRNaseがコンタミしていたのではないかと考えています。皆さんありがとうございました。

APさん
回答ありがとうございます。
以前うまくいっていたというのは、同じターゲット遺伝子、プローブ配列だったため、うまくいくはずということでした。

(無題) 削除/引用
No.4539-6 - 2015/10/31 (土) 12:07:27 - AP
>確かにおっしゃる様な不完全長のRNA転写が行われている可能性はありますが、以前はうまくいっているのが悩みの種です

伸長性は鋳型の二次構造の取りやすさ、Aの含有率（プローブのUTP頻度）など配列に依存するので、あれができたからこれもできるということにはならないでしょう。悩むところではないのでは。

In vitro transcription後のRNAの分解 削除/引用
No.4539-5 - 2015/10/30 (金) 13:28:25 - ISHer
回答ありがとうございます。

おおさん
目的遺伝子は1000bです。
ゲノムをテンプレートにしてPCR後にゲル精製しております。
精製したDNAは泳動してシングルバンドであることを確認しております。
確かにおっしゃる様な不完全長のRNA転写が行われている可能性はありますが、以前はうまくいっているのが悩みの種です。ただしゲノムテンプレートは別の動物ですが...

seventhさん
やはり最終手段としてPCRの代わりにプラスミドに入れてやるしかないでしょうね...
DIG-UTPの比率に関して検討してみます。

(無題) 削除/引用
No.4539-4 - 2015/10/30 (金) 12:42:24 - seventh
おおさんが言われているようにテンプレートのPCR断片に目的外のものが混じっているかもしれないので、一度プラスミドに入れて均一化したほうが良いかもしれないです。
また、DIG-UTP取り込みによる標識の場合は配列の組成や長さによっては途中で転写が止まってしまうことも有ります。完全長が欲しい場合はDIG-UTPの比率を下げる方法もあったと思います。

(無題) 削除/引用
No.4539-3 - 2015/10/29 (木) 22:41:09 - おお
長さはどれぐらいでしょうか?
マウスゲノムを電気えいどうで精製しているのですか?

PCR後に電気えいどう、精製はしてないのですか?PCRフラグメントに電気えいどうで認識しにくいけど、短いフラグメントができている可能性はないでしょうか?

あとは伸長しにくい配列で全長まで伸びにくいとか。

In vitro transcription後のRNAの分解 削除/引用
No.4539-2 - 2015/10/29 (木) 21:59:07 - ISHer
追記ですが、スメアの始まりは目的遺伝子長から始まっております...

In vitro transcription後のRNAの分解 削除/引用
No.4539-1 - 2015/10/29 (木) 21:55:43 - ISHer
In situ hybridization に用いるDIGラベルRNAプローブを作成していますが、転写後のRNAを電気電気泳動すると低分子側にスメアを引いており、分解が疑われております。
流れは以下の通りです。

・マウス尻尾からのフェノクロ・エタ沈によるDNA精製
・QIAquick Gel Extraction KitとZymo社Zyppyカラムによるゲル精製（泳動バッファーは新しいものに入れ替えている）
・T7プロモーター付のプライマーによるPCR
・PCR産物をテンプレートにしてロシュのT7ポリメラーゼによるIn vitro transcription
・変性ゲル、熱変性させたサンプルを用いて電気泳動

以前にこの手順で同じ同プライマーによるISHまで成功しております。
問題点はロシュから提供されるコントロールDNAを転写するとシングルバンドでRNAを確認できますが、PCR産物はスメアを引いていることです。（CTRLはうまくいっているので転写、RNA電気泳動は問題なさそう）

転写以前のRNAaseコンタミを疑っており、テンプレートDNAを別の動物にしたり、DNA泳動バッファーを新しくしたりゲル精製をZymoのキットを使うなどしましたが、依然としてRNAはスメアを引いています。

PCR試薬はジェノタイピングに用いるものと共有しておりますので、まずはそれらを一新して再度PCRからやり直そうと考えております。

同様の経験をお持ちの方や、何かお気づきの方はアドバイスよろしくお願い致します。
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