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(無題) 削除/引用 No.4536-5 - 2015/10/30 (金) 07:11:05 - F みなさま、コメントありがとうございました。 私の書き方がよくなかったと思いますが、PBSで培養というよりは、いろんなプロトコールによると PBS中でクロスリンキング反応させる必要があるので、その間、細胞はそもそもPBS中で元気な ものなのかな、と思って質問した次第です。プロトコールに書いてあるのでそれに従うのが 基本でしょうし、やってみておかしかったら自分でオプチマイズしないとなぁ、とは思ってましたが PBS中での細胞生存率ってどんなもんじゃろ？、という素朴な疑問が沸いてきたでした。 それなりに長年培養細胞を使ってきてて、こんなことも知らないんだなぁ、自分、と。 クロスリンキング反応自体は、momさんが書かれたようにやりました。 違いは、反応を室温で３０分〜１時間でまずはやってみたことくらいでしょうか。 あとは、DSPのストックソリューションの濃度を単純な計算ミスで１０倍濃くしてしまったので PBSに添加したら、析出して真っ白けになってしまったことです（苦笑。 それでも、自分の実験信念に則り、最後までやりきろうと、昨晩はO/NでIP中で、 今日明日でSDS-PAGE→IBです。 DSPは析出するもんなんでしょうか？ちょっとくらい出てもそこは目をつぶってやるのが DSPの場合は普通なんでしょうかね？ がんばってみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4536-4 - 2015/10/29 (木) 12:44:25 - mon DSPのクロスリンクは以下の方法で行っていました。 DSPを培養用DMSOに溶かして(-20℃保存）、室温のPBS(+)で10倍に希釈＝PBS-10%DMSOの状態（発熱するので室温程度に戻す）、PBS(+)でリンスした細胞に優しく注ぎ、通常の室内で氷上クロスリンク「5-10分」。なお、冷たいPBSだと希釈したとき沈殿が生じたような... その後、TBS(-)でリンス２回後、RIPA等で溶解させ、回収。Tris-baseを使う理由は残存DPSの不活化。 PBS(+)は用事調製でその日しか使えない（沈殿する）ので、HBSS (+)が便利かも。

(無題) 削除/引用 No.4536-3 - 2015/10/29 (木) 10:13:08 - 独り言 そもそもDSP処理のときにインキュベーターに入れる必要があるのですか？血清飢餓など予期せぬ細胞応答が起きると思いますが。4度じゃ駄目なんですか。4度ならPBS中でも数時間は普通大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.4536-2 - 2015/10/29 (木) 07:54:52 - dtssp DSPでクロスリンクするのにPBS中で培養する必要あるかな？ 洗うだけで普通は十分だと思います。 むしろ、環境が変わるので相互作用しているタンパク質の状態も変化する気もします。 また、PBS(-)ならカルシウムなどの2価カチオンも入っていないので影響は大きいでしょう。 血清を気にするとかなら、無血清培地を使えばよいと思う。 HBSSの方がグルコースが入っているので、PBSよりはましかも。 どうしても培養したいというなら、無血清培地＞HBSS (+)＞PBS (+)＞PBS (-)だと思います。

PBS中での細胞株のViability 削除/引用 No.4536-1 - 2015/10/29 (木) 06:55:13 - F いつも勉強させていただいています。 がん細胞株を10%FBS培地でsub-confluentまで培養して、PBSで２回ほどウォッシュした後、 PBSを加えてCO2インキュベータ内で0.5-数時間置いておこうと思っているのですが、細胞株による とは思いますが、PBS中での生存率ってどれくらいなものなんでしょうか？ ご経験のある方、いらっしゃいましたら教えてください。 ちなみにPBSに置換する理由は、DSPでクロスリンキング反応させるためです。

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