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(無題) 削除/引用 No.4535-7 - 2015/10/29 (木) 16:34:17 - yyy 技術的問題の他に、使うTaqポリメラーゼの種類が原因の可能性もあると思います。 以前に、某会社の一番安いTaqでは普通にコロPが出来てたのが、それが製造中止になって、同じ会社の新製品のTaqでは同じようにやっても全くうまく行かない、という経験をしました。結局、2つくらい別の会社のTaqを試してもかからなくて、3つ目くらいの安いTaqでやっと上手くいくようになって解決しましたが。

(無題) 削除/引用 No.4535-6 - 2015/10/29 (木) 14:05:26 - あ 問題を解決できるまともな同僚が実験を行うのが一番てっとり早い。

(無題) 削除/引用 No.4535-5 - 2015/10/29 (木) 09:40:08 - AP 文面から察するに、ズボラで横着であることがうまくいかない原因。

(無題) 削除/引用 No.4535-4 - 2015/10/29 (木) 06:52:45 - mon 皆様も指摘していますが、質問する場合は問題点をハッキリさせましょう。 問題点が判らない場合は、その旨を記載してください。科学的思考法の基本です。 さて、 (1)PCRそのものに問題が無いか？plasmid(miniprepでもよい）やすでにあるPCR産物を鋳型にしたポジコンのPCRは問題なく成功するのでしょうか？ これが問題ないとすると (2)コロニーの中のPCR鋳型(plasmid)に問題がある（インサートがない、primerがアニールする領域が欠失している、primerを間違えている） (3)PCR反応液中の大腸菌量が多すぎる：コロニーを爪楊枝でピックしてPCR反応液に直接いれると、大過剰でPCRは成功しません。コロニーをピックして、一旦別の寒天培地になでて（植え継いで）そのまま爪楊枝をPCR反応液にいれるくらいでOKです。これは乾燥した爪楊枝がPCR反応液を吸い上げることをある程度防いでくれます。 なお、BSA、ThrombinやBetaineを添加すると菌体由来のPCR阻害物質の影響をある程度軽減してくれます。例えば ttp://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2014/December/Bovine-thrombin-enhances-the-efficiency-and-specificity-of-polymerase-chain-reaction/biotechniques-355584.html

(無題) 削除/引用 No.4535-3 - 2015/10/28 (水) 23:04:05 - おお そこで詰まっているよりは、大腸菌のコロニーはすでに手元にあるのだから、プラスミド精製して制限酵素などでインサートを確かめなさいよ。

(無題) 削除/引用 No.4535-2 - 2015/10/28 (水) 23:03:18 - ppp どこが、どう、うまくできていないかを明確にするのが手っ取り早いです。

コロニーPCRがうまくいきません 削除/引用 No.4535-1 - 2015/10/28 (水) 22:54:25 - cPCR どうするのが一番てっとり早いでしょうか？

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