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プラスミドコンストラクトのシークエンス 削除/引用 No.4530-6 - 2015/10/27 (火) 16:27:06 - さる おおさん 大抵は3クローンほどグリセロールストックと プラスミドベクターを保存しています。 場所取りますが。 ご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4530-5 - 2015/10/27 (火) 14:11:22 - おお 大腸菌の方がPCRよりかなり正確です。念のために正しいと思われるものを2クローン持っておくといいでしょう。

プラスミドコンストラクトのシークエンス 削除/引用 No.4530-4 - 2015/10/27 (火) 13:40:04 - さる eraさん、おおさん 早速のお返事ありがとうございます。 遺伝子Dは制限酵素配列を付加したプライマーを用いて PCRで作製したもので、それ以外の部分も含め制限酵素で 切り貼りしています。 D、およびその上流、下流をメインにシークエンスを 進めようかと思います。 今一、大腸菌を信用できていません。もっと愛すべき ですね。 自分の行っていることに自信が持てないときに このフォーラムで皆さんの意見を参考にさせて いただいており、いつも大変助かっております。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4530-3 - 2015/10/27 (火) 13:01:23 - おお どの様にして挿入したのかによります。PCRしていない部分はあまり読む必要を感じません。 PCRせずに挿入したのであればブラントとかであればシーケンスでジャンクションの部分を主に確認すればいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4530-2 - 2015/10/27 (火) 12:57:47 - era どのようにして作製したかによります。 制限酵素で切り貼りしただけなら、つなぎ目だけで十分だろうし、PCRで増やしたのなら増やした箇所は読んだ方が安心できます。 例えば、1の場合にAを制限酵素で除いて、他のベクターに入っていてすでにシークエンスを確認しているDを制限酵素で切っていれるのであれば、Dの5'末とDとBのつなぎ目を確認します。 全長および既にわかっているBとCのつなぎ目のシークエンスは不要だと思います。 最近のPCR酵素は正確なのでそんなにエラーは入らないのですが、PCRのステップがあるなら、その部分はシークエンスを確認したいところです。

プラスミドコンストラクトのシークエンス 削除/引用 No.4530-1 - 2015/10/27 (火) 12:37:45 - さる お世話になっております。 A＋B＋Cという3種類の組換えタンパク質がつながって発現する事がすでに確認されているプラスミドベクターをベースに、Aの代わりに新たにDという蛋白質を以下のように挿入しました。 1.　D＋B＋C 2.　D＋C 3.　B＋C とれたプラスミドベクターに関してシークエンスを確認しようと考えているのですが、 1.　Dの上流、D+B全長、BとCの接続部 2.　Dの上流、Dの全長、DとCの接続部 3.　Bの上流、Bの全長、BとCの接続部 と考えたのですが、やはり全長を読むべきでしょうか。 施設にシークエンサーが無く、外注しております。 D＋B＋Cあわせて全長で約3kb程あり（特にCが長い）、クローン数を稼ぐとなると、先立つものが・・・・。 皆さんのご意見をお聞かせ下さい。 よろしくお願いいたします。

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