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(無題) 削除/引用 No.4512-10 - 2015/10/23 (金) 20:51:14 - GFP PI陰性のゲート設定によると思います。もし、自家蛍光と同じレベルまでを陰性とし、それ以上の蛍光領域を全てゲートアウトしているのであれば、漏れ込みの問題はない（それでもPEを用いた最終的な解析ではFL2/FL3間の補正が問題になりそう）と思います。一方、明らかにPI強陽性の分画をゲートアウトして、残りの細胞を「陰性」として解析した場合、陰性細胞でもPIのバックグラウンド染色が残り、これが漏れ込みの原因になるように思いました。染色時の濃度にもよりますが、PIの蛍光は結構強いと思いますので、バックの染色レベルでもFL2では問題になるかもしれません。アポトーシスのアッセイなどではPIをFL2で検出したりしますし。

(無題) 削除/引用 No.4512-9 - 2015/10/23 (金) 07:31:13 - おお PI陽性は除いてますよね、、、

(無題) 削除/引用 No.4512-8 - 2015/10/23 (金) 03:22:39 - GFP GFP陽性細胞の発現レベルが広い（自家蛍光のバックと比べて1logから4log上まで広がっている）場合、中等度のGFP発現細胞できちんと補正されている状態でも、高発現の細胞では補正不十分になってしまい、困った事があります。この場合、高発現の細胞できちんと補正される条件にすると、逆に弱陽性あるいは中等度陽性の細胞で補正過剰になってしまい、GFP陽性細胞全体をきちんと補正するのが困難でした。漏れ込みの程度は、GFP高発現細胞で少し傾いてしまうくらいだったので、定性的な解析は可能と思いましたが、MFIで定量的な解析をするには不十分と思います。 一点、質問を見ていて気になったのが、PIの併用です。GFPをFL1、Integrin-PEをFL2で見るとなると、PIはFL3でしょうか？　FL2とFL3でPEとPIの補正をするのは、EGFPとPEの補正より大変と思います。EGFPではなくPIのFL2への漏れ込みを見ている可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4512-7 - 2015/10/23 (金) 02:53:18 - TK-1 >[Re:4] HIHさんは書きました : > EGFPはFITCよりPE側に蛍光波長がある上に、強制発現細胞などの指標に用いるくらい発現強度が高いと、PEへのもれこみが補正不可能になることはよくあります。 > これは嘘でしょ。

(無題) 削除/引用 No.4512-6 - 2015/10/22 (木) 14:59:16 - FACS+calibur HIH様、ありがとうございます。 やはり補正不可能になるのですね。 voltageを下げることは経験がありませんのでどの程度影響するか確認してみます。 488のアルゴンレーザーしかありませんが、PE-Cy7あたりがありますので、それでも行うように準備したいと思います。 Loach様、HIH様、大変有益なアドバイスをいただきまして、誠にありがとうございます。 >[Re:4] HIHさんは書きました : > EGFPはFITCよりPE側に蛍光波長がある上に、強制発現細胞などの指標に用いるくらい発現強度が高いと、PEへのもれこみが補正不可能になることはよくあります。 > > 工夫の範囲としては補正値ではなくVOltageを下げて調整してみるとか、Bufferとかによっても蛍光の出方が変わったりするのでそのあたりを変えてみるとかですが。 > > いずれにしてもその状態でPEについて解析しても正確な結果にはならないのでもれこみのない他の色を使うべきでしょう。Caliburなら（レーザーが乗ってれば）APCとか。

(無題) 削除/引用 No.4512-5 - 2015/10/22 (木) 14:55:52 - FACS+calibur Loach様、ありがとうございます。 感染前の細胞をFITC, PEで染めたことはありませんが、おそらくうまくdistinctに分けられると思います。EGFPに限って起こるような印象を持っています。特にEGFPの発現が強すぎるようなpopulationではどうしてもPEへの漏れこみをふせげない印象を持っています。 >[Re:3] Loachさんは書きました : > 私はCalibur, Aria, C6 accuriを使用した経験があります。 > > GFPとPEの組み合わせは一般的に使われていると思いますが、compensationのトラブルはEGFP感染細胞に限って起こるのでしょうか？ > 例えば感染させる前の細胞を使って他にFITC+PEのような染め方をしていてそっちは問題なく検出できるとか、そういう情報はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4512-4 - 2015/10/21 (水) 17:46:23 - HIH EGFPはFITCよりPE側に蛍光波長がある上に、強制発現細胞などの指標に用いるくらい発現強度が高いと、PEへのもれこみが補正不可能になることはよくあります。 工夫の範囲としては補正値ではなくVOltageを下げて調整してみるとか、Bufferとかによっても蛍光の出方が変わったりするのでそのあたりを変えてみるとかですが。 いずれにしてもその状態でPEについて解析しても正確な結果にはならないのでもれこみのない他の色を使うべきでしょう。Caliburなら（レーザーが乗ってれば）APCとか。

(無題) 削除/引用 No.4512-3 - 2015/10/21 (水) 14:28:49 - Loach 私はCalibur, Aria, C6 accuriを使用した経験があります。 GFPとPEの組み合わせは一般的に使われていると思いますが、compensationのトラブルはEGFP感染細胞に限って起こるのでしょうか？ 例えば感染させる前の細胞を使って他にFITC+PEのような染め方をしていてそっちは問題なく検出できるとか、そういう情報はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4512-2 - 2015/10/21 (水) 05:38:45 - FACS+calibur 誤字が多く大変申し訳ありません。 ネガティブコントロールとして"IRES-EGFP"のみを感染させると、PI-, doublet-にゲート（死細胞を除き、シングル細胞にのみゲート）したのち解析すると、きちんとEGFP陽性細胞が現れてきますが、PE-isotypeもしくは未染色細胞であってもFL2 filterへの漏れ込みが酷いです。特にEGFPの発現が高いほど漏れ込んでいます。

EGFP (FL1)のPE (FL2)への漏れ込み 削除/引用 No.4512-1 - 2015/10/21 (水) 05:35:55 - FACS calibur お世話になります。 現在、レンチウイルスにより"geneX-IRES-EGFP"を発現させ、感染細胞にゲート(EGFP+)としたのち、細胞表面のβ２インテグリンの発現量を見る予定です。 ネガティブコントロールとして"IRES-EGFP"のみを感染させると、PI-, doublet-にゲート（死細胞を除き、シングル細胞にのみゲート）したのちんい解析すると、きちんとEGFP陽性細胞が現れてきますが、FL2 filterへの漏れ込みが酷いです。特にEGFPの発現が高いほど漏れ込んでいます。 EGFPの蛍光波長が、FL2の検出域に入るため補正を行おうとしていますが、compensationをなぶってもFL2チャネルのバックが下がってきません。変わりません。（FL2% FL1やFL1% FL2のところです） 論文でも［アイソタイプコントロールなのになぜこんなにバックが高いんだ？］というような図を見ますが、コンペンセーションでも解決できないようなことがあるんでしょうか？Immunityとかそういった雑誌でもそういう図を見ますので、仕方のないこともあるんでしょうか。 だとすると、EGFPの有無でインテグリンの発現量をフローサイトメトリーで比較するにはどうしたらいいのだろうかと悩んでいます。単純にMFI ("MFI of anti-Integurin" minus "MFI of isotype control")で比較しても大丈夫なのか不安です。どうかお力をいただければと思います。 よろしくお願いします。

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