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(無題) 削除/引用 No.4508-12 - 2015/10/22 (木) 09:39:34 - tana > 教えて頂いた試薬選択の部分で誤りがあったようです。 > 勉強になりました。ありがとうございました。 どのような誤りがあったのか、報告してもらえると ここを見ている他の人のためにもなると思います。

(無題) 削除/引用 No.4508-11 - 2015/10/22 (木) 03:25:05 - しろ >[Re:1] 超初心者さんは書きました : > RT-PCR（Applied Biosystems ViiA7)を用いてジェノタイピングを行うことになりましたが、経験のある方がいなくなってしまったので困っています。 > > TaqMan genptyping PCR Master mix(2x),TaqMan SNP genotyping assay(40x) > を使用して10uL/well standardモードで２度行いました。 当方TaqMan Master mix(2x)を用いてApplied Biosystems ViiA7でqPCRしています。96穴プレートで20マイクロL/wellで走らせております。参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.4508-10 - 2015/10/21 (水) 14:33:09 - おお マニュアルなど読もうとされている英語の解説のリンクはれないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4508-9 - 2015/10/21 (水) 14:29:39 - 超初心者 皆様ありがとうございました。 教えて頂いた試薬選択の部分で誤りがあったようです。 勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4508-8 - 2015/10/21 (水) 12:12:06 - 超初心者 rt様 コントロールはなく、自分のサンプルだけです。別の方から渡されたサンプルですが、そのサンプルには問題がないと考えています。 増幅曲線を見ると、FAMとVICの蛍光強度は増えており、ROXの値が異常に高い状態なのです。フィルターが汚れているとかは考えられるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4508-7 - 2015/10/20 (火) 14:23:30 - rt コントロールというのは、すでのホモかヘテロかわかっているサンプルのことで、FAMとVICの蛍光強度で3種のパターンに分類されることがこの方法ですよね。 コントロールを用いても予想される結果がでないのか、コントロールを使用しないで自分のサンプルで上手くいかないのかで、問題点がかわります。。

(無題) 削除/引用 No.4508-6 - 2015/10/20 (火) 13:30:07 - AP >realtime PCRをRT-PCRと表記する人もたまに見かけますよね。 あきらかに誤用なので、出くわしたら可能なかぎり注意してあげてます。 よそで恥かくよりいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4508-5 - 2015/10/20 (火) 13:15:19 - 超初心者 皆様早速のアドバイスありがとうございます。 きり様 なるほど…。それは知りませんでした。 Taqman SNP genotyping assay は新しく購入し、Taqman genotyping PCR master mix は以前使用されていた残りを使用しています。 AP様 realtime-PCRと表記するべきでした。ご指摘ありがとうございます。 rt様 templateの入れていないネガティヴコントロールでも同じくROXの強度が高くなっています。

(無題) 削除/引用 No.4508-4 - 2015/10/20 (火) 12:50:50 - rt realtime PCRをRT-PCRと表記する人もたまに見かけますよね。 そういうことでしょう。 それはさておき、コントロールはちゃんとできていますか？

(無題) 削除/引用 No.4508-3 - 2015/10/20 (火) 12:31:44 - AP genoetypingならゲノムDNAの解析じゃないの？ なんでRT-PCR? RT-PCRのRTはreverse transcription

(無題) 削除/引用 No.4508-2 - 2015/10/20 (火) 12:20:08 - きり ROXが高いってことは、機械に適してないpremixを使っちゃったとか？ ROXにはlowとhighがあるので。 ViiA7はlowみたいですね。

RT-PCRでのgenotypingについて 削除/引用 No.4508-1 - 2015/10/20 (火) 11:52:17 - 超初心者 いつも勉強させていただいております。 RT-PCR（Applied Biosystems ViiA7)を用いてジェノタイピングを行うことになりましたが、経験のある方がいなくなってしまったので困っています。 TaqMan genptyping PCR Master mix(2x),TaqMan SNP genotyping assay(40x) を使用して10uL/well standardモードで２度行いました。その結果、タイピング不可とされ、Raw Data やMulticomponent Plotを見てみると、パッシブリファレンスのROX色素の強度が異常に高く、これが関係しているのかもと思いました。リポーター色素の方はそれなりに増幅しており、2度とも同じ傾向です。ピペッティングエラーとも思えず、解析ソフトの設定の問題かと思い調べておりますが、なにぶん英語が多くて辿り着きません。 何か考えられる原因についてアドバイスをいただけたら助かります。よろしくお願いいたします。

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