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(無題) 削除/引用 No.4503-17 - 2015/10/20 (火) 08:16:41 - h APさん色々ありがとうございます。RNAzol良さそうですね！値段もむしろTrizolより安かったので（ほぼ同じぐらいですが）、次回はRNAzolを購入してみようと思います。 前回書くの忘れてたんですが、フェノールの飽和・平衡化について、自分が作ったわけではないフェノールなのでしっかり飽和されてるのか分からないのですが（水ではなくpH低めのTrisで飽和されてます）、同じ条件で体積が減少しないサンプルもあるため、まあその辺は大丈夫なんじゃないかと楽観視しています。 でも「作業温度に戻してから使用しているか」ですが、これって結構クリティカルなんでしょうか…？今まで一度も意識したことなかった点で、大体のフェノクロステップは4度で遠心するので問題がこれまで表面化しなかっただけなのかもしれませんが、割と重要なら今後意識しようと思います。Trizolは割と室温での作業時間があるので、結構重要な点なのかもしれないですね。 そのTrizolの作業ですが、前回自分で出した質問が妙に気になったので、Thermo Fisher? Life Technologies?に聞いてみました（Trizol出してる会社名って何か妙に変遷し続けてる気がします）。 For the RNA wash step, 7500xg is sufficient to pellet the RNA, however if you prefer you may stick with 12000xg as in the isopropanol precipitation step. The only possible pitfall from spinning at a higher speed during the wash step is that your pellet may be more condensed at the end and be more difficult to resuspend. If this is the case you can heat the pellet to 50C and vortex to aid resuspension. 落とし穴のくだりがホンマかいなという気がしないでもないですが（むしろロスを防ぐためにcondenceされてた方がいいような）、とりあえずそこまで問題はないようで安心しました（しばしばマニュアルに従わず最高速で回していたので）。参考になる方がいれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4503-16 - 2015/10/19 (月) 12:26:17 - AP ちなみに、ちょっと前にトピに上げましたが、TrizolなどAGPC法で相分離でRNAを回収する方法の進化版(開発者は同じくChomczynski）、RNAzolとかIsogen IIの商品名で出ているやつは上清と沈殿に分離させ上清を回収します。相分離で苦労しなくてすみます。 最近、使用する機会がありましたが、中間層の吸込みにいらいらすることもなく、またDNAなどの不純物の混入も少ないみたいで、良い感じでした。これがあればTrizolにもどる理由はみつかりません。

(無題) 削除/引用 No.4503-15 - 2015/10/18 (日) 00:23:14 - h 皆さん回答アドバイスありがとうございました。層分離よりも赤みの話が中心になってしまいましたが、大変ためになりました。 一連の操作は現在自分より後輩が中心でやっているので、各操作後の結果を見せられて「こうなったけど大丈夫なのか？」的な感じでして、各ステップの状況をつぶさには見ていないのですが、最終RNAペレットが真っ赤なこともままあった記憶があります。また、もう何年も前の記憶ですが、in vitro転写後にTrizolで精製していたこともありまして、そういえば当時もどんなに注意して水相を吸ったつもりでも、エタ沈（Trizolではイソプロ沈ですかね）後の廃液がうっすらと赤みがかっていて「あれ、下層も吸っちゃってたのかな。もっと気をつけなきゃ」などと思ってた記憶が蘇ってきたんですが、そもそも下層を吸わずとも水相にTrizol由来の赤い色素が微量混入してしまうことはない話ではないようですね（そもそもどちらも完全に100％極性・無極性なわけではないと思うので当然かもしれませんが）。 あ、そういえばずっと気になっていたことを思い出したんで、この機会に横槍ですが最後に一つだけ質問追加です。大した話じゃないんですが、Trizolのマニュアルでのエタノールリンスって、何故7500 xgという指定なんでしょう？別にそれで問題があるわけでも不満があるわけでもないですが、あえて相分離やイソプロ沈時のスピード(12000 xg)から変わっている以上、何か合理的あるいは積極的な理由があるはずだと思うのですが、皆目見当がつきません（スピードをわざわざ下げる理由が分からない）。この点に何か一家言ある方いらっしゃいましたらご意見いただけるとありがたいです。 層分離に関しては、やはりたまたま細胞数が多かっただとかで溶液組成が変わり、何らかの成分が何がしかの悪さをして分離に何か悪影響を及ぼしているという可能性が高そうですね（ほぼ何も分かっていないのと同じ状況ですが…）。なるべく悪い成分を薄めるために、クロロホルムや水を追加して様子を見るというのは解決につながりそうです。次回問題に遭遇したら試してみるよう後輩に伝えてみます。重ね重ね色々なアドバイス大変ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4503-14 - 2015/10/17 (土) 21:02:50 - 弘法 ade2などで見られる赤い色素は、蓄積した代謝中間体である5-aminoimidazole ribotide（AIR）が酸化的に重合したものです。水溶性ですが、濃度によってはエタノール沈澱で除けないこともあります。 気になるようでしたら、培地に十分量のアデニンを加えておけばアデニン合成経路が抑制されてAIRの蓄積が起こらず、色素の生成を避けることができます。

(無題) 削除/引用 No.4503-13 - 2015/10/17 (土) 17:19:31 - mi1 Trizol上層が赤くなることは酵母に限らずありますね。 サンプル由来の色が原因なこともあるし、試薬の色素が水層に残ることもあると思います。 原因はわかりませんが、強いて言えば多糖類などの夾雑物で水層の性質がおかしくなったときになるという印象を持っています。 RNAがきれいかどうかは別として赤い色素自体はエタ沈で抜けるのでそれほど問題になっていないですが。

(無題) 削除/引用 No.4503-12 - 2015/10/17 (土) 16:41:09 - AP >たしか、酵母には赤い色素を作る系統がありましたよね。 最初の質問文しか読まずに書き込みしたんですが、この考えには自らもう行き着いていたんですね。 >>サンプル由来の赤色（培地からAdeが欠乏した時に酵母が赤くなるアレです）なのではないかという気もしてきました。

(無題) 削除/引用 No.4503-11 - 2015/10/17 (土) 13:59:44 - AP >えーっと経験論なんですが、Trizolの水層にもう一度trizolを入れてクロロフォルム添加後えんしんしたら若干水層が赤みを帯びてたりします。 そうなんですか。 でもTrizolの水層はグアニジンITCやサルコシルなどの水溶性成分が、ほぼそのままキャリーオーバーされているはずで、そこに再びTrizolを入れるとそういった成分が過多になって余計な物（色素）まで溶けやすくなっているのかも。

(無題) 削除/引用 No.4503-9 - 2015/10/17 (土) 13:40:06 - おお >[Re:7] APさんは書きました : > 水溶性の赤い色素を持っているんじゃないですか。酵母のことは全くわかりませんが、たしか、酵母には赤い色素を作る系統がありましたよね。アデニン要求性だったか。それでなくても何らかのメタボライトが着色している可能性はあります。ちなみにショウジョウバエだと眼の色素で水層が赤みがかります。 > Trizolに入っている色素は疎水性のはずで、分離した有機層溶媒層があるにもかかわらず水層に入ってくることはないと思います。 えーっと経験論なんですが、Trizolの水層にもう一度trizolを入れてクロロフォルム添加後えんしんしたら若干水層が赤みを帯びてたりします。 ただ今回の場合何か酵母の持っている色素かなっていう気もしますが、水層に不純物が多いかなっていうきもするので、酵母にたいするtrizolの量もあげた方がよいかなとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4503-8 - 2015/10/17 (土) 13:30:47 - AP >フェノクロ後、水層の量が劇的に減少していることがあります フェノクロはちゃんと水飽和されてますよね。飽和状態は温度によって変化します。ちゃんと作業温度に平衡化してから使用していますか。 冷蔵庫から出したばかりの冷えた状態で加えると、室温になったときにだいぶ吸水するはずです。

(無題) 削除/引用 No.4503-7 - 2015/10/17 (土) 13:27:08 - AP 水溶性の赤い色素を持っているんじゃないですか。酵母のことは全くわかりませんが、たしか、酵母には赤い色素を作る系統がありましたよね。アデニン要求性だったか。それでなくても何らかのメタボライトが着色している可能性はあります。ちなみにショウジョウバエだと眼の色素で水層が赤みがかります。 Trizolに入っている色素は疎水性のはずで、分離した有機層溶媒層があるにもかかわらず水層に入ってくることはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4503-6 - 2015/10/17 (土) 13:13:39 - h ふみさんありがとうございます。 冗長な割に分かりにくい記述で申し訳ない限りなのですが、既に長すぎたため最初の投稿では触れなかったこととして、もしかしたら水相の赤みの原因はTrizolに含まれる色素ではなく、サンプル由来の赤色（培地からAdeが欠乏した時に酵母が赤くなるアレです）なのではないかという気もしてきました。 この赤色が何者なのかもよく知らないのですが、実際の相分離の結果から鑑みるに恐らく水溶性であり、今回質問した「Trizolの分離の悪さ」とこの「水相が赤みがかかること」とは完全に独立した無関係な事象だったのかもしれません（しかしTrizol後の水相が本来予想されるより少なく、続くフェノクロ処理でさらに水が奪われるという現象には実際悩まされており、これはTrizolの分離の悪さのせいかと思います）。 水を足すという案は既に実行しており、その時はたまたま赤みがかった水相だったんですが、「水相の量がフェノクロ処理後に減るであろう」との予想のもと200 uL程水を足してフェノクロ処理をしたのですが、遠心後に水相の容量が一切減らなかったという結果になりました（この結果をもとに、『フェノクロ処理後水層の量が減少しない上に赤色成分すら水層にとどまり続ける』と記述しました）。しかしよく考えると、これを試したときは、水相は赤みがかっていたものの、色に目をつむれば分離自体はよくできていたようにも思えます。フェノクロ後に水相が減少する場合はTrizolの分離の時点で既に若干水相が減少しており、分離が何だかイマイチという感じです。 というわけで後出しな上、本当に冗長で下手な説明で申し訳ないですが、改めて考えるとどうも水相への赤い色素のコンタミは、Trizolの分離とは無関係の事象なのかもしれないという気がしてきました（もちろん赤みがかって分離が悪いこともありますが、それらは偶然赤い色素が含まれる事象と分離の悪さが重なっただけであったと思われます）。 次回分離が悪いなと感じた時は、おおさんのクロロホルムを足すというアドバイスを実行し、それでもなお水相が通常より有意に少ないままであるようならふみさんのアドバイス通り水を足してみようと思います。ご意見どうもありがとうございました！

水層の比重が大きい 削除/引用 No.4503-5 - 2015/10/17 (土) 12:34:56 - ふみ さっき不思議と書いたのも含めて、水層の比重が大きくて分離が悪いのだろうと思い直しました。

水を少し足すに1票 削除/引用 No.4503-4 - 2015/10/17 (土) 12:29:07 - ふみ 分離が悪ければ水100uLぐらい加えてからボルテックスし直して遠心したらよいだろうと思います。 ただ、"またさらにいうと、赤みがかった上層を用いた場合に、フェノクロ処理後水層の量が減少しない上に赤色成分すら水層にとどまり続ける"のは不思議です。

(無題) 削除/引用 No.4503-3 - 2015/10/17 (土) 12:26:16 - h おおさんありがとうございます。 なるほど、クロロホルムを追加ですか！そもそも有機溶媒のクロロホルムを加えてなぜ突然水相が出現するのかずっと疑問だったのですが、クロロホルムがTrizol中に含まれている水分子を有機層から追い出す(?)のかなと今勝手に思ったんですが（どなたか正しい原理ご存知の方いらしたらご教示いただけると大変嬉しいです）、もしこの推測が正しいなら、クロロホルムを追加するのはさらに水分子を吐き出させることになって意味がありそうですね。次回この問題に遭遇したら試してみようと思います。どうもありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4503-2 - 2015/10/17 (土) 12:01:12 - おお クロロフォルムを入れて状況によっては相分離しない場合がありその時はさらにクロロフォルムをいれて相分離させてからえんしんで水そうを回収するといいという話をきいたことがあります。あとサンプルに対するtrizolの量を増やすと相分離するようになるケースは多いと思います。

Trizolの分離が悪い 削除/引用 No.4503-1 - 2015/10/17 (土) 10:50:19 - h Trizolで酵母からRNAを取っているのですが、稀にクロロホルムを加えた後の遠心後の層分離がイマイチなことがあります。 ttps://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf マニュアルのPhase separation step 5の後、本来透明層と赤い有機層に分かれるはずですが、サンプルによって透明層が非常に赤みがかっていることがあります（重要な点として、きれいに分かれるサンプルもあります。両者はストレインが違う点以外はほぼすべて同じだと思うのですが、主に実験しているのが後輩の学生なのでひょっとしたら細胞数が違ったりするかもしれません）。 また、うちのラボではよりきれいなRNAを取るべく、このステップ後にフェノクロ処理を1回かましているのですが、赤みがかった上層のみならず、透明な上層を用いた場合でも、フェノクロ後、水層の量が劇的に減少していることがあります（400 uLの上層を入れたのに、フェノクロ遠心後、100 uLぐらいに減っている（もちろんその分有機層が増えている）ような感じです）。（またさらにいうと、赤みがかった上層を用いた場合に、フェノクロ処理後水層の量が減少しない上に赤色成分すら水層にとどまり続ける、という場合もあります。要は何だか一貫性のないバラバラな結果が得られている感じです。） 一応以上のことを踏まえると、恐らくTrizolの層分離後の上層に、有機成分が多量に混じっているのではないかと考えているのですが（そうとも思えない結果になることもあるのがなんとも言えないですが）、どなたかこうなる原因とその対策についてピンと来る方はいらっしゃいますでしょうか。細胞数が多すぎとか、Trizolが古くなっている（実際そんなに古くはないのですが）とかが直感的にあり得そうな原因な気もしますが、根拠も自信もありません。 何かアドバイスありましたらよろしくお願いいたします。

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