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(無題) 削除/引用 No.4501-12 - 2015/10/18 (日) 07:23:50 - おお >Hepatoma 細胞名を明かしてくれると、その細胞ならこの方法でうまくいっているとかいろいろコメントがつきやすいと思います。PEIは万能ではなく、293など研究室でよくつかわれる、比較的どんな試薬でもtransfectionしやすい細胞にたいしてはいい結果をもたらすけど、スペクトルが狭いような気がします。 Hepatomaはむかしのリポフェクタミンの方がよく入りそうな印象がある。

(無題) 削除/引用 No.4501-11 - 2015/10/17 (土) 20:45:24 - mon >[Re:9] あかねさんは書きました : > 導入効率って細胞周期に影響されるんですか？！それは知りませんでした、、、 文献は沢山あります。例えば ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10694822 また、293細胞の場合、導入操作後luciferaseの発現は早ければ3時間ほどから検出され、徐々に活性は上がっていきます。EGFPの蛍光は4-6時間ほどから観察出来ます。

(無題) 削除/引用 No.4501-10 - 2015/10/17 (土) 13:42:13 - おお 11kbのベクターはそんなに大きくないのではないかと思います (2)

(無題) 削除/引用 No.4501-9 - 2015/10/17 (土) 13:35:54 - あかね > 実施したことは無いですが、「毒性が問題にならなければ」導入効率は細胞周期に影響されるので効果はあるかもしれません。 いつも横からすいません、、、、 導入効率って細胞周期に影響されるんですか？！それは知りませんでした、、、 やはり活発に分裂している細胞でないと難しいんでしょうか？でもトランスフェクションを開始して実際のところ何時間目あたりで入るもんは入るんでしょ、、、

(無題) 削除/引用 No.4501-8 - 2015/10/17 (土) 13:11:39 - mon 少し時間はかかりますし目的に合うか不明ですが、 puromycin耐性遺伝子を同時に使用して、puromycinで2-3日間非導入細胞を殺す方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.4501-7 - 2015/10/17 (土) 11:46:02 - toto コメントだけですが、ヒトHepatomaで25％の効率というのは、かなりのものです。倍にまであげることはtransientでは無理なような印象が個人的にはしていますが、どなたかから何か出てこないかと期待して覗いています。どちらかというと細胞の状態の改善が有効な感じはしてましたが、再現性あるよい条件を確立できたことはありません。 普通、こういう場合は、皆さんの言われるようにウイルスを使うか、FACSで分けるということになるかと思うのですが、何かありますか。

(無題) 削除/引用 No.4501-6 - 2015/10/17 (土) 04:53:08 - GFP 私も同じように導入効率が問題になったことがあります。 連続transfectionはlipofectionで試しました。たくさん入った、という結果にはなりませんでした。PEIではどうかわかりませんが。 私は、EGFPも発現ベクターに組み込んで（タンパクの機能に問題が出そうだったのでfusionにはせず、pIRESベクターを使った）、FACSで蛍光ポジティブな細胞とそうでないのをソーティングして、それぞれをゲルに流しました。 お手元にベクターなりフローサイトメーターなりがあるなら案外簡単に出来るかもしれません。 ところで、多分同じような意見が出てくると思いますが、11kbのベクターはそんなに大きくないのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4501-5 - 2015/10/16 (金) 17:17:53 - mon 1. 連続transfection 実施したことは無いですが、「毒性が問題にならなければ」導入効率は細胞周期に影響されるので効果はあるかもしれません。 2.transfection時の溶液のvolumeを減らす PEI/DNA複合体と細胞の接触頻度を上げるので効果はあると思います（毒性は出やすくなります）。 plateごと遠心するのも効果があります。ブレーキ無しにしないと細胞が剥がれることがあります。 その他：経験から PEI/DNA複合体を先に入れて細胞懸濁液を後から加える(reverse transfection)のも、毒性が問題にならなければ効果的です。 遺伝子導入時、血清含有培地より無血清培地の方が効率は良い（接触量・頻度の差??）。 PEI/DNA複合体を作製するとき、HanksBSS(-)や無血清培地よりD-PBS(-)中の方が効率が良い細胞がある（複合体の大きさの差??） PEI-MAXの分子量は、40KDaより2.5kDaの方が毒性が少なく導入効率もやや良い〜同等。ただしHBSS溶液(10mg/mL：pH調製なし)-20℃保存時劣化?（導入効率の低下）が早い時があったので、長期保存Stockは-80℃にしている。 なお、lipofectionと比較して細胞内シグナルへの影響は大きいようなので、慎重にコントロール群を設定してください。

(無題) 削除/引用 No.4501-4 - 2015/10/16 (金) 17:06:49 - tet 誘導発現系に移して、安定発現株をとってくるのはどうでしょう？ もしくは、48時間後で見るなら改変アデノとか効率よいかも。

(無題) 削除/引用 No.4501-3 - 2015/10/16 (金) 16:54:26 - あかね ごめんなさい間違えましたー。

(無題) 削除/引用 No.4501-2 - 2015/10/16 (金) 16:51:28 - あかね トピ主ではないですが質問を横からそっと、、、、、 Current protocols pf molecular biologyを参考にSDSPAGEしてますが、 APSやTEMEDの濃度って数倍上げても問題ないのですか？それともゲル漏出防止のため先端にのみ濃いのを置く？ ゲル全体を数倍高いAPS/TEMEDで作っちゃだめなのですかね？？？

トランスフェクション導入効率を上げる工夫(PEImax) 削除/引用 No.4501-1 - 2015/10/16 (金) 16:45:33 - 極貧ラボ 現在、ヒトhepatoma細胞株へ遺伝子導入を試みています。 ラボの経済状況からPEImaxを利用したものでできればと思っています。 これまでレンチや（隣のラボにお願いして使わせてもらった）Neon等試しましたが、約11 kbとややプラスミドが大きいためか困難でした。 PEImaxは293T細胞やCHO細胞などで6-8割の導入効率を再現できていますが、今回のhepatoma細胞では20%-25%ほどがGFP陽性です。（ポジコンのpEGFPベクターではです） この細胞はある遺伝子をノックアウトしてあり、そのレスキュー実験（KOされた遺伝子を戻す）をPEImaxを利用して行いたいです。 計画では遺伝子導入後、48時間後にウエスタン予定ですが、なかなか見たいレスキュー効果が現れていません。KOマウスの表現系解析から、その細胞の表現系は遺伝子の KOに依ると自信を持っています。なので、おそらくレスキューできないのではなく、そもそも導入効率が悪いため、レスキュー効果が見えにくい（あるいは時間もかかるのかもしれませんが）のでは？と考えています。 できればもう少し導入効率を上げたいです（経済状況からPEImaxを使うこと前提でお願いします）。そこで次の方法を試してみたいです。 1. 連続transfection つまり、day0にPEImaxでtransfectionします。8時間後？（自信はないです）に培地を吸引除去し、改めてtransfectionし直します。これを続けていって48時間目に回収というのは目的達成できるでしょうか。あるいは最初の8時間のtransfection後に通常の培地に変更して、翌日二度目のtransfectionを8時間ほど行うというのでもいいかもしれません。 邪道なやり方で、無理せずウイルスやら代替手段を探すのがプロだというのは承知なのですが、25%まではいっているのでもう少し上げられたら(50%ほど)と思ってPEIを使えればと思っています。 連続transfectionで最終的な導入効率の上昇は期待できますでしょうか？ あるいはそれ以外の方法でtransfection時の溶液のvolumeを減らす（現在6-well plate 1wellに対して、2 ml加えていますが、これを1 mlに減らすなど？）ことも良い方向に向かうことがありますでしょうか？ みなさまのコメントをいただけますと幸いです。

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