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(無題) 削除/引用 No.4490-28 - 2015/11/23 (月) 03:01:21 - おお バイオラッドですべて新しいの揃えてやると私の手技的には、まずほとんど成功します。一番よくある主な原因は私の経験の限り、 重ねたガラスプレートの底が微妙にずれているとか、欠けているとか。見てすぐわかるのは使わないようにしてますが、摩耗してちょっと触るとガタガタになっていると気付くとかそういうので漏れることも良くあります。その他ガスケットなども使用していくうちにダメになっていくというのがここのトピでも議論されています。

(無題) 削除/引用 No.4490-27 - 2015/11/22 (日) 17:30:18 - TS ＞うちのラボでも一人の達人を除いてゲル作成成功率は50-75％ぐらい これは低すぎではないでしょうか。なにか道具の方に問題があるように思えます。うちでは、学部生でも90％以上の成功率です。 とは言っても、成功率90％なら製品としてはだめと思いますが。。。 いろいろ古くて、ガラス版がかけてるとか、スポンジがぼろぼろとか、かたくなっているとか。 よくあるのは、TEMEDやAPSが古いとか。新調すると急に良くなったりしますね。 ＞ゲルができても電気泳動の時にゲル板をよく濡らしとかないとバッファーもれすることもあります これもゴムパッキンが固くなってたりしませんかね。結構強く締め付けるし、そんなに漏れないと思うのだけど。 バイオラッドの味方とか、123さんを中傷しているという意図は全くありませんので、誤解のないようににお願いします。 バイオラッドのものは、構造上、失敗はありえるわけですが、道具や試薬も含めて、きちんどすれば成功率は90％以上にできると思います。 うちでももちろん失敗はあるのですが、どれだけ100％に限りなく近づけられるかどうか、くらいの感覚です。まぁ私も30枚に一枚くらいは失敗するかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.4490-26 - 2015/11/20 (金) 20:06:51 - 123 　このトピを見つけるのが遅かったですが、同じことで悩んでる人がいるみたいですね。うちのラボでも一人の達人を除いてゲル作成成功率は50-75％ぐらいでした。達人に聞いても全然コツがつかめなかったです。なのでバイオラッドの人に聞いたらパラフィルム挟むことは言われましたがそれでも失敗します。ばねの部分にボールペンもはさんでいます。 　それよりもTGX FastCastだとほぼ100%成功します。ゲル1枚300円ですがプレキャストよりは安いので便利です。パラフィルム置いたりボールペンはさんだりしなくてもゲルが漏れることはないので、トリスやアクリルアミドの試薬が悪かったのか？とも思いましたがそこは解決していません。 　ゲルができても電気泳動の時にゲル板をよく濡らしとかないとバッファーもれすることもありますのであのセット大嫌いです。

(無題) 削除/引用 No.4490-25 - 2015/10/17 (土) 09:23:08 - おお TEMEDは上げるとあまりよくないという話がありますよね。なるだけ少なく心がけているのでもしかしたら出回っているプロとコールより低いかもしれません。脱気せずにできるようにかけっこう多めのプロとコールもあります。 APSを上げて速さは確かにコントロールできますけど、どうなんでしょうね熱が出ますよね。。。あと上にイソプロとか重層している間に固まってしまうのも。。。 もう一つの懸念は注げば注ぐほど圧が高くなるので漏れが激しくなってくる。

(無題) 削除/引用 No.4490-24 - 2015/10/17 (土) 06:35:24 - あかね おおさん有り難う御座います。 そうでした。何も考えずに上げてしまうと脱気の時間が十分持てなくなりますもんね。 浅はかでした。有り難う御座います。

(無題) 削除/引用 No.4490-23 - 2015/10/16 (金) 20:46:26 - おお >[Re:22] あかねさんは書きました : > 正しくはこちらでした、、、、、、 > > トピ主ではないですが質問を横からそっと、、、、、 > > Current protocols pf molecular biologyを参考にSDSPAGEしてますが、 APSやTEMEDの濃度って数倍上げても問題ないのですか？それともゲル漏出防止のため先端にのみ濃いのを置く？ ゲルの底だけ量をいじってます。そのほかは私は脱気をして無駄に量をあげないように心がけてます。

(無題) 削除/引用 No.4490-22 - 2015/10/16 (金) 16:55:06 - あかね 正しくはこちらでした、、、、、、 トピ主ではないですが質問を横からそっと、、、、、 Current protocols pf molecular biologyを参考にSDSPAGEしてますが、 APSやTEMEDの濃度って数倍上げても問題ないのですか？それともゲル漏出防止のため先端にのみ濃いのを置く？ ゲル全体を数倍高いAPS/TEMEDで作っちゃだめなのですかね？？？

(無題) 削除/引用 No.4490-21 - 2015/10/16 (金) 16:11:30 - IKE 自分もよく失敗しました。 何回かに１回は液漏れしてしまいます。 なんでこんな使いにくい製品を出しているのか疑問でなりません。 既製のゲルを買わせるためじゃないかと思えてなりません。

(無題) 削除/引用 No.4490-20 - 2015/10/15 (木) 12:16:36 - おお ところで周りの人はうまくいってるんでしょうかねぇ。。。何かちょっとしたコツを見落としているだけかもっていうきも。

(無題) 削除/引用 No.4490-19 - 2015/10/15 (木) 10:55:08 - ggg もう問題点は出尽くした感がありますけど、 1. ガラス 2. ガスケット 3. スタンドのばね のいずれかに不具合があると漏れますよね。 私も、以前はガスケットとガラスを新調してもれなくなりました。 新調してもダメなのは、ガラスが平行ではないか欠けている、もしくはスタンド自体の問題ではないかと思います。 スタンドのバネが弱っていると漏れやすくなるので1mlのチップを挟んでましたが、結構壊れるという意見もあるようで、加減が必要そうです。 ちなみに、今は値段もだいぶ安くなってきたのでプレキャストを買っちゃってます。

(無題) 削除/引用 No.4490-18 - 2015/10/15 (木) 07:47:25 - おお >アガロースを使う場合にはまさかのTAEやTBEでしょうか？？ググってもでてきませんでした。濃度もいくつでしょうか。もしご存知でしたら後学のために教えてください！ resolving(lower) gelのバッファーでいいと思うよ。tris-glycinの方法だとたしか375mM Tris-HCl pH8.8じゃなかったでしょうか。私はmodifyしてますのでちょっと違いますけど。 TEMED/APSの量は環境で幅があるので何ともいえませんけど。。。いれて水平になったらすぐ固まるぐらいです。私はTEMEDを多めに入れてますが、3倍ぐらいかな。。。ゲルが混ぜてからすぐ固まるのを防ぐのにon iceで冷やした状態でTEMED/APSを加えるとある程度余裕ができるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4490-17 - 2015/10/15 (木) 07:04:05 - K おおさんの初めの書き込みで気付いたんですが、あのガスケット、そもそも昔はラバータイプだったんですかね…？スタンドの数が足りなくなって隣のラボに借りに行った時に、あまりにペッチャンコのガッチガチなガスケットに「何だこれ！こんなんもうゴムじゃねーか！！」とか思ってたんですが、何のことはないそもそもゴム製だったんですね。（でもそれは抜きにしても真っ黄色に黄ばんで、ベットベトでもうスタンドから剥がせないような状態だったので、彼らのが劣化著しいのは間違いないと思いますが…） それはさておき、最初の書き込みではガスケットを新調すれば完璧、二度と漏れることはなくなるでしょう的なこと書いたんですが、ガスケットとガラス板を新調してからは実際自分でやっていて漏れることは一切なくなったものの、undergraduatesとかはたまに漏らしたりしているのも見かけるので、apeさんが「あまり効果なかった」とおっしゃっている通り、新品にしたからと言って完璧ではないかもしれないので、あまり過度な期待をされない方がいいかもしれません。 よく見る学生の漏れの原因は、緑のスタンドにゲルのカスが固まっていたりして、真っ直ぐにゲル板をセットしたつもりがゲルカスに引っかかって微妙にゆがんでいた、といったことが多い気がします。ゲル板底部をフラットにセットするのが何より重要で、新品のガスケットできっちりフラットにセットすれば、恐らく漏れはなくなるんじゃないかと思いますが…（が、こう書くと「apeさんは雑に扱っているから漏らしている」と同義になってしまうのであまり声高に主張はできませんが…）。 洗い方に関しては、今の所長期間新品同様の質を保てているとは思うものの、ガスケット博士ではないのでBio-Radに聞いてみました（水のリンスで十分か、それともsqueezeした方がいいか）。回答がこちらです。 It is made from a thermoplastic material that swells when soaked in water. Since this swelling affects the size of the gasket, we recommend that the gasket be clean and dry before casting gels. I admire that you take such good care of your equipment! I imagine that the gaskets will air-dry more quickly if they are squeezed between paper towel after a water rinse. But we have not tested this. By the next morning the gaskets should be dry anyway. …割と情報量のないしょぼい回答な気がしないでもないですが、まぁ水のリンスで表面の汚れを落とせば十分と考えて良さそうですね。個人的には、水を流しながら指で優しく表面を拭って、気持ち軽くつまんで内部の液を出してやってる、みたいな感じで、洗い後は特に拭いたりせずそのまま風乾しています。使用後放置さえしなければ割と長くもってくれるものだと思います。参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4490-16 - 2015/10/15 (木) 02:24:18 - もうだめぽ たていすさん、ありがとうございます。 そうなんですよね。そうなんですが、あまりにストレスで誹謗中傷し兼ねないと思い自制からそうしてしまいました。 apeさん、ありがとうございます。 ラボの同僚はガスケットの上にパラフィルムを敷いていましたが、ガラス板に逆に貼り付けるんですね。その方が確かに密着性がいいような気がしてきました。次回取り入れてみます！ まっくろんさん、ありがとうございます。 やはりガスケットの乾燥は重要みたいですね。パラフィルムの使用も公式に推奨されているとのことなので、早速ランチ後にゲル作成をしてみます。 皆様、大変稚拙な質問に対し、丁寧にご回答いただきまして、誠にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4490-15 - 2015/10/15 (木) 02:20:44 - もうだめぽ おおさん、ありがとうございます。 TEMEDとAPSを数倍高くすればイソプロなどの重層は必要ないんですね。てっきり空気との接触を避けなければならないと思っていましたので驚きです。 何倍ほどでしょうかね。3倍くらい？でしょうか。 アガロースを使う場合にはまさかのTAEやTBEでしょうか？？ググってもでてきませんでした。濃度もいくつでしょうか。もしご存知でしたら後学のために教えてください！ 中年さん、ありがとうございます。 ワセリン・・（笑） そんなことまでせんといかんのかあorz となりますね。 ４枚作って半分ゲルが作れれば大成功だぜと満面の笑みで言われたんですが、時間と試薬代が。。ラボの中国人は自作を諦めて自分一人コマーシャルなゲルをBio-radから買って実験してます（笑）

(無題) 削除/引用 No.4490-14 - 2015/10/14 (水) 20:44:13 - まっくろん こちらは留め具の所に1000ulチップを挟んですっかり解決しました。うちのガスケットだと、チップを挟むとしっかりめり込むような感じになるので、これでうまく止まらないとすれば、ガスケットも劣化してるのかなと感じます。ちなみにチップを挟む前にメーカーに問い合わせた際は、対処法として、「ガスケットをよく乾かして」と「パラフィルムを2-3枚重ねてガスケットの上に敷く」と教えてもらいました。

(無題) 削除/引用 No.4490-13 - 2015/10/14 (水) 19:37:03 - ape うちのラボも同じものを使用しており、漏れるようになったため 灰色のガスケットを新調しましたが、あまり効果はありませんでした。 確実なのはパラフィルムです。勿体ないのですが、5〜8mm×4〜5cm 程度の小片を緑のクリップに挟んだゲル板の底面にきっちり密着させて、 最初と最後の両端も少し上まで立ち上げるように密着させます。 この状態でゲルスタンドに設置して、ゲルを作製していますが、 今のところ問題はありません。

(無題) 削除/引用 No.4490-12 - 2015/10/14 (水) 17:09:49 - たていす 別に誹謗中傷しているわけではないので、Oio-Oadにすることはないんじゃない？ 同じように困っている人がいたとしても、Oio-Oadでは検索に載りませんよね。

(無題) 削除/引用 No.4490-11 - 2015/10/14 (水) 13:31:44 - おお あ、あの下の灰色のラバーっていってたやつgasketっていうんだった。

(無題) 削除/引用 No.4490-10 - 2015/10/14 (水) 13:25:41 - 中年 ガスケットを新しくすればきっと解決します。うちではそうでした。 古い大きいタイプを使っていた頃、アメリカ人のラボメイトが漏れを防ぐのにワセリン（petroleum jelly）をたっぷり盛っているのを見て気が遠くなったのを思い出します。

(無題) 削除/引用 No.4490-9 - 2015/10/14 (水) 13:13:17 - おお まあアガロースはやったことありませんが、アガロースでもいいのでは?

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