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(無題) 削除/引用 No.4489-4 - 2015/10/13 (火) 21:03:02 - som 低張液を用いた方法です。 データシート上では、IPにも適用できると記載されております。 Triton-X100を含んだLysis bufferで調製したTotal cell lysateを用いたIPではWBによる検出ができました。分画はしたことがなく、未確認です。 しかし、この検出もまだ1回できただけです。 IPで目的のタンパクが落とせない状態です。抗体との相性が悪いのか、などなどIPの条件等を検討中といった段階です。 ただ、一度 Lysateだと検出できましたので、タンパクが可溶化できていないということ、WBではSDSサンプルバッファーで可溶化されていたということが可能性としてありえるか、教えていただきたく質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.4489-3 - 2015/10/13 (火) 20:53:22 - mon または（蛍光）免疫染色できる抗体であればIPにも使用可能な場合が多いですけど。

(無題) 削除/引用 No.4489-2 - 2015/10/13 (火) 20:49:37 - mon 抽出条件の記載が曖昧で膜分画がどのような状態か検討出来ませんが（おそらく一般的な低張液を使う方法だと思いますが）、そもそもお使いの抗体がIPできる抗体であることは確認していますか？ 例えば界面活性剤で可溶化した分画（WBで目的タンパクの有無を確認したもの）でIPできますか？ （ただし、1%Triton X100存在下で結合できない抗体もあるので注意）

タンパク質の可溶化（抽出）について 削除/引用 No.4489-1 - 2015/10/13 (火) 20:44:01 - som 細胞を分画し、それぞれの画分をIPやWBに用いています。 細胞を破砕する際に用いるバッファーは、スクロースとEDTA-2Naからなり、界面活性剤等は含まれておらず、分画後のPelletもこのバッファーで懸濁しています。 WBでは膜結合タンパク質を検出しているのですが、問題なく検出されていました。しかし、IPをした後にWBで検出すると検出されません。 WBでは、SDSサンプルバッファーによって可溶化されたため検出されていたのでは、と考えました。 IPでは膜に結合したまま抗体とうまく反応出来なかったのでは、と。 しかし、同じタンパク質をターゲットにしている論文で「界面活性剤が含まれていないバッファーによる抽出だと、WBに用いた際に検出されなかった」と報告しているものもありました。 SDSサンプルバッファーによるタンパク質可溶化の可能性について、ご教授願えればと思います。 よろしくお願い致します。

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