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(無題) 削除/引用 No.4489-26 - 2015/10/15 (木) 08:16:00 - mon > コンタミした膜が可溶化して検出された、という以外の理由 界面活性剤で剥がれる程度の結合力で他の因子（タンパク？）がエピトープに結合しているとか、界面活性剤で高次構造が変わってエピトープが露出するとか？

(無題) 削除/引用 No.4489-25 - 2015/10/15 (木) 08:13:15 - おお >[Re:24] somさんは書きました : > 「細胞質画分において、界面活性剤なしのIPでは沈降しなかったものが界面活性剤を加えることで沈降した」 > この際に、遠心で水溶性画分を拾ってきているとはいえ、膜画分のコンタミ等が疑われることはないのでしょうか（それぞれの画分に局在するタンパクでWBをして示す、という方法もあるかもしれませんが）。 > コンタミした膜が可溶化して検出された、という以外の理由が思い浮かびませんでした。 > ぜひ、教えていただければと思います。 まず、水溶性の蛋白でもdetergentsの存在かでIPが可能になるということはあり得ると思います。 超遠心後にどの程度膜フラクションが残っているかはよくわかりませんけど、あなたのこれまでの実験結果から考えごく微量なので膜のコンタミを見ている可能性が払拭できないと感じるならば、それは経験ある実験者の感覚なのでそれを否定するつもりはありません。 そういえば、TRITON X-114を使えば膜結合型の蛋白を効率よく除くことができるかもしれません。1-2%ぐらい加えて40度ぐらいにして遠心するとTRITON X-114はそれぐらいの高い温度で不溶性になり、膜蛋白を巻き込んで底にたまります。上層の水層をとれば、膜蛋白が除かれたフラクションを得ることができます。まあ一般論的にはそう言うことですので、いかなる時でも絶対そうだとはいえませんけど。 脂質の修飾は場合によっては電気えいどうで分子量の差で見れたりしますが、対象のものではどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4489-24 - 2015/10/14 (水) 20:08:47 - som > > >また、細胞質(可溶性)画分のタンパクにおいても、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない、ということはありますでしょうか。 > > > あります。IPできてるんじゃなかったっけ?細胞質画分からは。 > > > それは、一般論では、どういった場合が考えられるのでしょうか。 この質問について補足させてください。 「細胞質画分において、界面活性剤なしのIPでは沈降しなかったものが界面活性剤を加えることで沈降した」 この際に、遠心で水溶性画分を拾ってきているとはいえ、膜画分のコンタミ等が疑われることはないのでしょうか（それぞれの画分に局在するタンパクでWBをして示す、という方法もあるかもしれませんが）。 コンタミした膜が可溶化して検出された、という以外の理由が思い浮かびませんでした。 ぜひ、教えていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.4489-23 - 2015/10/14 (水) 19:36:39 - おお >[Re:22] somさんは書きました : > > > というのはもしあなたの蛋白に何か違う蛋白が結合していて、その蛋白のサイズがたまたま一緒でその結合しているタンパク質が修飾されていたという最悪のシナリオを除外できるからです。 > > 目的タンパクに結合したタンパクが修飾されていた場合ですが、この場合WB(SDS-PAGE)をした際に、違う分子量域に検出されるかと思ったのですが、そうはならないのでしょうか。 かならずともそうは限らないでしょうといわれればなんとdefendするのですか。 > > >代わりに得られた膜フラクションを0.5-1%のSDSで溶解していったんボイルして蛋白を変性させて、1%Triton X-100 (or NP-40) 0.1% deoxycholateを含む生理的塩濃度のバッファーで10倍程度に希釈して(最終SDS濃度0.1%以下)にして、その溶液に抗体、ビーズをいれてIPという方法を私はとることがまあまああります。 > > この方法は拝見したことがなかったです。 > 細胞質画分にも界面活性剤処理を施す場合にはどういった方法がありますか。もともとタンパク濃度が薄いことと、沈殿の形で得られないので上記のように希釈する過程を経るのは難しいのですが・・・。 それ以上薄められないというならTCAまたはアセトンやメタノールクロロフォルム法などで沈殿させるというのもありかもしれません。 またはSDSを入れて変性したあと1% TritonX-100 0.1% deoxycholateをふくむbufferで透析というのもできなくはないかと。ただ大きいミセルを形成しているだろうから、buffer置換にけっこう時間がかかるだろうなという気はしますけど。

(無題) 削除/引用 No.4489-22 - 2015/10/14 (水) 15:45:49 - som > というのはもしあなたの蛋白に何か違う蛋白が結合していて、その蛋白のサイズがたまたま一緒でその結合しているタンパク質が修飾されていたという最悪のシナリオを除外できるからです。 目的タンパクに結合したタンパクが修飾されていた場合ですが、この場合WB(SDS-PAGE)をした際に、違う分子量域に検出されるかと思ったのですが、そうはならないのでしょうか。 >代わりに得られた膜フラクションを0.5-1%のSDSで溶解していったんボイルして蛋白を変性させて、1%Triton X-100 (or NP-40) 0.1% deoxycholateを含む生理的塩濃度のバッファーで10倍程度に希釈して(最終SDS濃度0.1%以下)にして、その溶液に抗体、ビーズをいれてIPという方法を私はとることがまあまああります。 この方法は拝見したことがなかったです。 細胞質画分にも界面活性剤処理を施す場合にはどういった方法がありますか。もともとタンパク濃度が薄いことと、沈殿の形で得られないので上記のように希釈する過程を経るのは難しいのですが・・・。 初歩的ですみません。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4489-21 - 2015/10/14 (水) 15:42:01 - som > >また、細胞質(可溶性)画分のタンパクにおいても、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない、ということはありますでしょうか。 > あります。IPできてるんじゃなかったっけ?細胞質画分からは。 それは、一般論では、どういった場合が考えられるのでしょうか。 （細胞質画分からもできていない状態です。当初はタンパク量が足りていないのかと思いましたが、存在量の多い膜画分からも検出されず、界面活性剤を用いて調製したTotal cell lysateからは検出されたので、そこが原因かと考えました。 その場合、IPを経ないで行うWBでは検出されているのは、SDSサンプルバッファーで可溶化されているから？と思い、ただ、それがあり得るのか分からなかったため、このトピックをたてました。）

(無題) 削除/引用 No.4489-19 - 2015/10/14 (水) 14:43:31 - おお >ただ、細胞質画分においては＝可溶性(水溶性)画分として扱いたいので、そこがネックになるかな、と思っています。 細胞質画分をとってきた段階で水溶性のものをとってきてるといえるのでそこにdetergentを加えるのは何ら問題はないと思ったのですが、、、 >また、細胞質(可溶性)画分のタンパクにおいても、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない、ということはありますでしょうか。 あります。IPできてるんじゃなかったっけ?細胞質画分からは。

(無題) 削除/引用 No.4489-18 - 2015/10/14 (水) 14:35:39 - おお 修飾を見るんだったら変性させた方がいいです。というのはもしあなたの蛋白に何か違う蛋白が結合していて、その蛋白のサイズがたまたま一緒でその結合しているタンパク質が修飾されていたという最悪のシナリオを除外できるからです。reviewerからそう言う突っ込みもあり得るということです。 なのでTCAは一つの選択肢でしょうけど、沈殿させた後の溶解するのにいろいろと障害がある場合があります。 代わりに得られた膜フラクションを0.5-1%のSDSで溶解していったんボイルして蛋白を変性させて、1%Triton X-100 (or NP-40) 0.1% deoxycholateを含む生理的塩濃度のバッファーで10倍程度に希釈して(最終SDS濃度0.1%以下)にして、その溶液に抗体、ビーズをいれてIPという方法を私はとることがまあまああります。 一度変性させているので、蛋白同士のinteractionはなくIPされてくるフラクションはあなたのタンパク質のみと主張できます(もちろんごくまれにrenatureする蛋白もありますけど、まあそこまで突っ込んだ人は今までないですね)。

(無題) 削除/引用 No.4489-17 - 2015/10/14 (水) 14:28:29 - som > IPの目的が不明ですが、界面活性剤で可溶化すると何か不都合があるのでしょうか？ 残されているプロトコルが界面活性剤を使用していないのでそれに沿ってやっておりました。おそらく、不都合はないと思います。 ただ、細胞質画分においては＝可溶性(水溶性)画分として扱いたいので、そこがネックになるかな、と思っています。 そこで、先ほど以下の質問をさせていただいた次第です。 ・・・また、細胞質(可溶性)画分のタンパクにおいても、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない、ということはありますでしょうか。 ただ、例えば界面活性剤ありのバッファーで分画した場合、細胞質画分を＝可溶性とはみなせないのかな、と思うのですが、どうなのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4489-16 - 2015/10/14 (水) 14:10:53 - som > 超遠心で膜を得ているのでその状態で濃縮されていると思いますが、それをワザワザげんだくしてIPするというのは、何か実験的な都合があるのでしょうか? 本当に見たいのはわずかにしかない細胞質画分に存在する方です。膜画分もIPしているのは、多く存在している方の膜画分ではきちんと沈降できているのかを確認するためです。それで細胞質画分はおろか、膜画分の方もWBをした際に検出できない、といった状態です。 >細胞膜はフラグメントにはなっていると思いますが、小胞状になっていると思います。小胞の内側にあれば抗体はアクセスできません。 なるほど。そういうこともあるのですね。ただ、今回目的としているタンパクは小胞の外側に結合しているとされているものです（内側にも存在しますが）。 最終的には目的タンパクの抗体でIPし、Ac-Lys抗体でWBし、翻訳後修飾を見たいと思っています。この場合TCA沈殿でも問題はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-15 - 2015/10/14 (水) 13:58:00 - おお 超遠心で膜を得ているのでその状態で濃縮されていると思いますが、それをワザワザげんだくしてIPするというのは、何か実験的な都合があるのでしょうか? まあそれはともかく、細胞膜はフラグメントにはなっていると思いますが、小胞状になっていると思います。ということはですよ、小胞の内側にあれば抗体はアクセスできません。細かいことはわかりませんが、細胞膜がフラグメント化したとき、どちらが内側になるかpreferenceがあるとしたら、そう言う理由でIPできないのかもしれません。とかきながら、このへんくわしいひといないかなぁっと。

(無題) 削除/引用 No.4489-14 - 2015/10/14 (水) 13:42:47 - mon ＞おそらく細胞質にもわずかに存在しているため、これを濃縮したいと考えIPを行っています。 WBで検出するためなら、TCA沈殿が簡便ですよ。全てのタンパクは変性し沈殿するので目的にもよります。 あるいはイオン交換レジンを用いたBatch精製も選択肢かも？

(無題) 削除/引用 No.4489-12 - 2015/10/14 (水) 13:34:32 - mon 分画中の膜由来成分の状況は想像出来ますか。 おおざっぱに、教科書的な分画処理を述べると、 細胞をTritionX100等を含む溶液で処理＞不溶性画分（核、細胞骨格）＋上清画分（細胞質タンパク、膜画分、オルガネラ由来タンパク、可溶化された脂質）ですし、 細胞を低張液で処理＞(1)不溶性画分（核、細胞骨格、遠心力によってはオルガネラ）＋(2)上清画分（細胞質タンパク、膜由来ミクロソーム（小胞）、遠心力によってはオルガネラ） 上清画分を強遠心＞(3)沈殿（膜由来ミクロソーム、オルガネラ）＋(4)上清：細胞質タンパク （密度勾配遠心や中程度の遠心力によってオルガネラを先に分画・沈殿することが可能） (2)(3)をTritionX100等を含む溶液で処理すれば、膜に結合していたタンパクを可溶化出来ます。 (2)の状態でIPできないとすると、おおさんの指摘のように（膜由来小胞に結合していて）「界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない」可能性がありますね。 IPの目的が不明ですが、界面活性剤で可溶化すると何か不都合があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4489-11 - 2015/10/14 (水) 13:22:36 - som サンプルは界面活性剤なしのバッファー（低張液）で懸濁し、Dounce型ホモジナイザーで破砕、遠心および超遠心により核画分、ミトコンドリア等の画分、細胞質画分と3つに分画しています。IPにも同様のサンプルを用いています。 そのサンプルにSDSサンプルバッファーを添加し、WBのサンプルとしています。 確かに、目的としているタンパクはペレットに多くが存在しています。 しかし、おそらく細胞質にもわずかに存在しているため、これを濃縮したいと考えIPを行っています。ただ、IPをすると、豊富にある膜画分でさえもこの目的タンパクが検出されなくなります。逆に膜画分には存在しないあるいはわずかと考えられる、脂質修飾されていない形のタンパクはIP後のWBで検出されます。 分かりにくくて申し訳ありません。 お力添えください。

(無題) 削除/引用 No.4489-10 - 2015/10/14 (水) 13:04:42 - おお WBはデタージェントなしのバッファーでlysisしてから、サンプルバッファーを加えてSDSPAGEをしているのですか? それとも細胞をいきなりサンプルバッファーで処理しているのですか? それによって解釈が変わってきます。 デタージェント抜きでlysisしたばあい、緩い遠心で核が除けますが、その上澄みはcytosolとミトコンドリアと膜フラクションです。このフラクションを高速で遠心すると、ミトコンドリアや膜フラクションの多くがペレットを形成します。もしそうしているのなら、IPできないのでなく、ペレットに目的のものがあり、使っている上澄みにはあなたの蛋白が無いという可能性もあります。 まあいずれにしろプロとコールがちゃんと明示されてませんのでどれかと言い当てることは難しいです。

(無題) 削除/引用 No.4489-9 - 2015/10/14 (水) 12:40:01 - som 皆さまありがとうございます。 WBでは、目的のタンパクは検出されています。サンプルの調製法はIPに用いるものと全く同じです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=550 こちらのフォーラムのおお様の解答で言いますと、 1)膜にタンパク自身が埋もれている。 2)たんぱく質が脂質など疎水せいの強いもので修飾をうけ膜にアンカリングされている。 3)たの膜局在タンパク質に相互作用することによってまくにそんざいする。 の中では２）に該当します。 脂質修飾を受ける前のタンパクはIP後のWBで検出されるのですが、受けた後のものが検出されません。 WBでは双方とも検出されています。 また、細胞質(可溶性)画分のタンパクにおいても、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできない、ということはありますでしょうか。 ただ、例えば界面活性剤ありのバッファーで分画した場合、細胞質画分を＝可溶性とはみなせないのかな、と思うのですが、どうなのでしょうか。 知識不足で申し訳ありません。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4489-8 - 2015/10/14 (水) 07:23:20 - mon なお、分画したときは、各可溶・不溶（あるいは上清・沈殿／下部）分画に目的タンパクの有無（量比）を確認するのが定法です。 また最適な可溶化法はタンパク毎に異なると考えた方が良いですよ。 例えば、活性や他のタンパクとの相互作用を検討するときに、汎用されるTritonやNP40での可溶化ではうまくいかない場合があります。

(無題) 削除/引用 No.4489-7 - 2015/10/14 (水) 07:14:16 - mon 膜タンパクでも裏打ちタンパク（構造）にも結合していて、膜分画（沈殿）を取ってきても何らかの可溶化が必要なものもあります。 おおさんも指摘していますが、全細胞のTriton可溶分画から目的タンパクがIPできるなら、膜分画をさらにTriton可溶分画と不溶分画に分け、WB・IPしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-6 - 2015/10/13 (火) 23:29:37 - おお たしかに膜貫通部位に近いところがエピトープになっていれば、界面活性剤なしでは抗体がアクセスできずIPできない可能性はあります。膜でなくても何かついていたり、構造的にアクセスができなかったりする可能性もありますが、理屈はさておきTRITONのようなものを加えてからIPしてみればいいかと思いますが、どうでしょうか? それともIP自身のスキル的なものを気にしているんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-5 - 2015/10/13 (火) 22:08:40 - あqswでfrgtひゅじこlp IP用に調製したサンプルをウェスタンしてみた？そこに目指すものがあるかどうかでその後の対策がかなり変わってくるとおもうんだが。そもそもちゃんと抽出されていなければ、どんな立派なIPのプロトコルでも、なにもないところからは何も取れないし。

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