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(無題) 削除/引用 No.4489-48 - 2015/10/28 (水) 23:54:02 - おお くわえます。1%SDSで処理する場合TX100/deoxycholateのはいった生理的塩濃度のバッファーで10倍に希釈します。0.1%SDS単独でうまくいくならTX100/deoxycholateは加えないでしょう。あるいはRIPAbuffer(TX100 deoxycholate SDSを含む)はIPでワークする(すべての抗体でとまでいえない)ことがわかっているのでそれにあわせたのかもしれません。 SDSの性質での懸念は単独で変性作用が強いことと、(今思い出しましたので加えると)低温で沈殿が生じる事がよくあるということです。

(無題) 削除/引用 No.4489-47 - 2015/10/28 (水) 23:00:09 - おお SDSはかなり強い界面活性剤です。単独で使用すると抗体やプロテインA/Gの活性が阻害されるか変性する可能性が高いのだと思います。SDS単独で使用したIPをしているのを見たことがありません。 しているとかいう論文、プロとコールがあればどなたか紹介していただけたらと思います。 界面活性剤は混ぜることで効果を減じることができるという話は(科学的ではないかもしれませんが)時よりききます。

(無題) 削除/引用 No.4489-46 - 2015/10/28 (水) 21:00:12 - som どうしても分からない点がありましたので、再度質問させていただきます。 引き続き、申し訳ありません。 「水溶性画分をTX114で処理して、万が一の膜のコンタミを除去して、0.1%SDSを加えてボイルしてからNP40(またはTX100)を0.5-1%、deoxycholateを0.05-0.1%ぐらいになるように加えてSDSの作用をブロックしてIPする」 この方法でやってみようと検討しております。（まずは、TX-114処理をせずにうまくいくかを試してみようと思います） そこで、再度質問なのですが、 SDSの濃度が0.1%の場合でもNP-40（TX-100）やdeoxycholateは、SDSの作用をブロックするために必要ということでしょうか。 また、TX-100あるいはdeoxyxholateどちらかではなく、両方を使用する意図はなんでしょうか。 何度もすみません。よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4489-45 - 2015/10/20 (火) 16:46:22 - som > それはずいぶんdiscussionしてきたと思いますが。。。少なくともエピトープ部位は修飾されていないだろうということです。なので水溶性のものがIPできないのはエピトープ部位の修飾ではないのでは?ということです。ただし、エピトープ部位の修飾で結合が弱くなっているのでIPでさがでたのではないかという仮説は100%否定できませんけど。 理解が追い付かず、申し訳ありません。 WBで検出出来てIPで出来ない理由は、 膜画分の場合は、膜に結合したまま（WBではSDSサンプルバッファーの作用でできる）、ということが考えられるということで良いのでしょうか・・・。 細胞質画分においては、エピト―プ部位の修飾以外で、WBができてIPができない場合にどういったことが考えられるでしょうか（ここから先は自分で考えるべきことかもしれませんが、何か定説みたいなものがあればご教授ください。）。 > 最初のプレパレーションでちょっとhypotonic bufferの量が多いのでは? > こないだ核のフラクションをとるために同じような作業をしましたけど、cytosolのフラクションは5mg/mlでした。大量の細胞を使ってますので、そのプロとコールに準じたものですが、しょうスケールではこの方法そのままでは溶液量があまりにも少なくなってしまいますけど、少なくとも液量は1/3-1/5ぐらいに減らせそうですけど。 約 3×10^6個の細胞数あたり500μlのバッファーでホモジナイズし、分画しています。核画分、膜画分を100μのバッファーで各2回washしており、細胞質画分は最終的に500μl+400μl=約900μlになり、その濃度が800μg/mlです。 核ペレットは４分の１量の450μlのバッファーで懸濁し、800μg/ml、 膜ペレットは８分の１量の225μlのバッファーで懸濁し、1.2 mg/ml くらいの濃度です。 もう少しバッファーの量を減らせそうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-44 - 2015/10/19 (月) 21:44:30 - おお >[Re:43] somさんは書きました : > > > 修飾が直接抗体の反応性に関与するなら(エピトープになっている部分が修飾されて抗体が結合できないなら)、IPでもWBでもworkしないでしょう。 > > これは界面活性剤処理如何に関わらず、ということでしょうか。 Yes > とすると、水溶性画分だけでなく、膜画分（脂質修飾されることが明らかになっている）においてもWBでは検出されてIPをすると検出できない状態です。水溶性画分は勿論、膜画分も含め全体としてこの現象をどう考えれば良いのでしょうか。 > (当初立てた仮説、SDSサンプルバッファーの作用は考えられないということか) それはずいぶんdiscussionしてきたと思いますが。。。少なくともエピトープ部位は修飾されていないだろうということです。なので水溶性のものがIPできないのはエピトープ部位の修飾ではないのでは?ということです。ただし、エピトープ部位の修飾で結合が弱くなっているのでIPでさがでたのではないかという仮説は100%否定できませんけど。 > ではなく、最初から0.1％SDSでOKということでしょうか。 > 溶液はSDSもTritonもdeoxyxhorateも、生理的塩濃度のバッファー(PBSなどで大丈夫でしょうか？)で良いですか？ まあやってみないとわからないところはありますけど、熱変性させますので。完全にSDSで変性したタンパク質1gにつき1.4gほどのSDSが結合しているといわれてます。その時の蛋白の濃度が1mg/mlなら結合しているSDSの濃度は1.4mg/ml (0.14%)になります。なので0.1%もあれば変性させるには少なすぎるということはないと思います。 IPなどは基本生理的食塩水の塩濃度のバッファーにしておくといいでしょう。PBSでいいと思います。 > > TCAやアセトンなどの沈殿は総蛋白で1mg/mlぐらいは欲しいかなと感覚的に思ってますが、、、そんなに薄いでしょうか? > > 細胞質画分ですと、800μg/ml程度です。今は2mg程を一度にIPしており、1.5mlチューブ2本に分けてやっており溶液量の多さを感じています。上記の方法なら1.12倍で同じく2本内に収まるのでこれまでと変わりない作業効率で出来るとは思います。ここにTX114処理を施すと更に薄くなるのかなと思っており、その場合もう少し溶液量を減らしたいなと思っています。 最初のプレパレーションでちょっとhypotonic bufferの量が多いのでは? こないだ核のフラクションをとるために同じような作業をしましたけど、cytosolのフラクションは5mg/mlでした。大量の細胞を使ってますので、そのプロとコールに準じたものですが、しょうスケールではこの方法そのままでは溶液量があまりにも少なくなってしまいますけど、少なくとも液量は1/3-1/5ぐらいに減らせそうですけど。

(無題) 削除/引用 No.4489-43 - 2015/10/19 (月) 17:20:13 - som > 修飾が直接抗体の反応性に関与するなら(エピトープになっている部分が修飾されて抗体が結合できないなら)、IPでもWBでもworkしないでしょう。 これは界面活性剤処理如何に関わらず、ということでしょうか。 とすると、水溶性画分だけでなく、膜画分（脂質修飾されることが明らかになっている）においてもWBでは検出されてIPをすると検出できない状態です。水溶性画分は勿論、膜画分も含め全体としてこの現象をどう考えれば良いのでしょうか。 (当初立てた仮説、SDSサンプルバッファーの作用は考えられないということか) > 0.1%のSDSを加えて熱変性と書きました。薄くなるのを考慮してのことです。これなら10%SDSであれば1mlにたいして10ulでいいです。さらにTritonなどを1%なら10%を100ul、さらにdeoxychorateを0.1%なら10%を10ulでお手もの溶液のvolumeは1.12倍に増えるだけです。どうでしょうか? 以前、教えていただいた、 「得られた膜フラクションを0.5-1%のSDSで溶解していったんボイルして蛋白を変性させて、1%Triton X-100 (or NP-40) 0.1% deoxycholateを含む生理的塩濃度のバッファーで10倍程度に希釈して(最終SDS濃度0.1%以下)にして、その溶液に抗体、ビーズをいれてIPという方法」 ではなく、最初から0.1％SDSでOKということでしょうか。 溶液はSDSもTritonもdeoxyxhorateも、生理的塩濃度のバッファー(PBSなどで大丈夫でしょうか？)で良いですか？ > TCAやアセトンなどの沈殿は総蛋白で1mg/mlぐらいは欲しいかなと感覚的に思ってますが、、、そんなに薄いでしょうか? 細胞質画分ですと、800μg/ml程度です。今は2mg程を一度にIPしており、1.5mlチューブ2本に分けてやっており溶液量の多さを感じています。上記の方法なら1.12倍で同じく2本内に収まるのでこれまでと変わりない作業効率で出来るとは思います。ここにTX114処理を施すと更に薄くなるのかなと思っており、その場合もう少し溶液量を減らしたいなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.4489-42 - 2015/10/19 (月) 02:39:39 - おお >例えばIPの前にアセトンやTCAを用いた沈殿法を用いることはできるのでしょうか。 タンパク同士のinteractionを無視するなら(今回の場合は無視しているとおもいます)logicalにはできると思います。不溶化してしまうものもあるのですが、それが回避できるなら使えると思います。沈殿を解かすのにdetergentのはいったバッファーを使うのがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4489-41 - 2015/10/19 (月) 02:07:13 - おお >おお様より、 >「水溶性の蛋白でもdetergentsの存在かでIPが可能になるということはあり得ると思います。」 >との解答を、 >mon様より、、 >「界面活性剤で剥がれる程度の結合力で他の因子（タンパク？）がエピトープに結合しているとか、界面活性剤で高次構造が変わってエピトープが露出するとか？」 との解答をしていただきました。 >この考察ではやはり矛盾は払拭できないでしょうか。 上記のコメントは修飾が直接抗体の反応性に関与してないことが前提でかかれています。 修飾が直接抗体の反応性に関与するなら(エピトープになっている部分が修飾されて抗体が結合できないなら)、IPでもWBでもworkしないでしょう。 もちろん修飾が間接的に抗体の反応性に関与している可能性を100%否定できるわけではありませんけど、それは実際にIPができれば検出が可能という話で実験されているわけですし、、、言いたいことは、結果ネガティブに出るかもしれませんので、違う仮説も立てておいた方がよくないでしょうかという話です。 溶液が薄くなるという話に関しては、一つ前の私のコメントでは、0.1%のSDSを加えて熱変性と書きました。薄くなるのを考慮してのことです。これなら10%SDSであれば1mlにたいして10ulでいいです。さらにTritonなどを1%なら10%を100ul、さらにdeoxychorateを0.1%なら10%を10ulでお手もの溶液のvolumeは1.12倍に増えるだけです。どうでしょうか? ただ懸念は抗体はものによってはdeoxycholateが使えないとかそう言うバリエーションは広いので、ただそれはやってみればわかるとおもいます。というのはその溶液には修飾されてないポジコンが共存してますから。 TCAやアセトンなどの沈殿は総蛋白で1mg/mlぐらいは欲しいかなと感覚的に思ってますが、、、そんなに薄いでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4489-40 - 2015/10/18 (日) 18:14:31 - som > そのスペキュレーションはできるかもしれませんが、その場合それを仮説として検証してそうだといいですけど、、、またブロックする方法が見つかればいいかもしれませんが、、、 > > スペキュレーションのうえにそうだとしても先がなんステップかあるという状況ではありますよね。勿論そこはやっている研究者の判断でやってはいけないわけではありませんけど。 そうですね。とりあえず、一度上清もWBにかけてみようと思います。その結果を見て考えます。 > もし、膜フラクションにあるlipidで修飾されたあなたのターゲット蛋白が効率的に除けるのであれば、水溶性画分にコンタミしている細胞膜についているあなたの蛋白はTX114で除けますよね。 > > TX114で除いたあとデタージェントで変性させれば、膜のコンタミからくるそのタンパク質の可能性は否定できますよね。 > > なので一つのアプローチとしては、水溶性画分をTX114で処理して、万が一の膜のコンタミを除去して、0.1%SDSを加えてボイルしてからNP40(またはTX100)を0.5-1%、deoxycholateを0.05-0.1%ぐらいになるように加えてSDSの作用をブロックしてIPするとどうでしょうか。 TX114で処理した後に更に界面活性剤を施すということですね。確かにその方法はいけそうな気がします。ただ、水溶性画分のタンパクが非常に薄くなりそうです。前実験者は水溶性画分をアセトン沈殿した上でWBにかけています。 その方が今はいないので、水溶性画分がどれくらいの液量となるのかわかりませんが、そこにさらに界面活性剤の処理を施すと、タンパク量を確保するのに液量がかなり多くなりIPに用いにくい気がしています。 例えばIPの前にアセトンやTCAを用いた沈殿法を用いることはできるのでしょうか。 （http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1268 こちらを見るとできないのかな、と思ったのですが、翻訳後修飾の場合どうなのでしょうか） > あ、それと水溶性のあなたのターゲットが脂質以外の修飾のためIPできないのではないかということですが、修飾されて抗体が認識できないのにWBで検出できるって言うのは矛盾がありませんか? 自分もそのように思い頭を悩ませ、当初の質問をしました。 WBにおいては検出出来てIPではできないのは、 WBにおいてはSDSサンプルバッファーの働きで可溶化していたから検出出来ていた、と考え、これがあり得ることなのかを最初に質問しました。 しかし、細胞質画分も同様にWBではできて、IPではできないのは、おかしいなという疑問はずっとありました。。 そこで、コンタミした膜が可溶化して検出された、という以外に、細胞質（水溶性）画分においても、界面活性剤が働いてIPができるようになることがあるか、という質問をしました。 おお様より、 「水溶性の蛋白でもdetergentsの存在かでIPが可能になるということはあり得ると思います。」 との解答を、 mon様より、、 「界面活性剤で剥がれる程度の結合力で他の因子（タンパク？）がエピトープに結合しているとか、界面活性剤で高次構造が変わってエピトープが露出するとか？」 との解答をしていただきました。 この考察ではやはり矛盾は払拭できないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-39 - 2015/10/17 (土) 12:31:14 - おお >[Re:38] somさんは書きました : > ・・・書きながら思ったのですが、確認できなかった場合、IP作業中のプロテアーゼ等による分解とかは考えられないでしょうか。 そのスペキュレーションはできるかもしれませんが、その場合それを仮説として検証してそうだといいですけど、、、またブロックする方法が見つかればいいかもしれませんが、、、 スペキュレーションのうえにそうだとしても先がなんステップかあるという状況ではありますよね。勿論そこはやっている研究者の判断でやってはいけないわけではありませんけど。 > > > > TX114で処理した際に、トータルホモジネートではdetergentと水溶性画分の両方に、膜画分ではdetergentの画分に検出されています。細胞質画分は水溶性画分のみに検出されています。 > もし、膜フラクションにあるlipidで修飾されたあなたのターゲット蛋白が効率的に除けるのであれば、水溶性画分にコンタミしている細胞膜についているあなたの蛋白はTX114で除けますよね。 TX114で除いたあとデタージェントで変性させれば、膜のコンタミからくるそのタンパク質の可能性は否定できますよね。 なので一つのアプローチとしては、水溶性画分をTX114で処理して、万が一の膜のコンタミを除去して、0.1%SDSを加えてボイルしてからNP40(またはTX100)を0.5-1%、deoxycholateを0.05-0.1%ぐらいになるように加えてSDSの作用をブロックしてIPするとどうでしょうか。 もう一つのアプローチはArgのmethylationでしたっけ?それに対する抗体でIPしてあなたの蛋白に対する抗体でWBをする。 また、あなたの蛋白に対する抗体で別の抗体で目的のバンドの蛋白がIPできるものを探すか、tagつきで発現してtagの抗体でIPする。 煮詰まってる部分があるので後者の2つアプローチの方が打開策が見られるのではないかという気もします。 あ、それと水溶性のあなたのターゲットが脂質以外の修飾のためIPできないのではないかということですが、修飾されて抗体が認識できないのにWBで検出できるって言うのは矛盾がありませんか? 確かに、修飾された部分に何か蛋白がinteractionしていればその可能性も否定はできませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4489-38 - 2015/10/15 (木) 16:24:14 - som > でならばやる意義があるの? IPされないことはわかってるんですよね。怒っているわけではないんですよ。なんか見えないのです。 確かにそうですね。ただ、心理的に、確認して、抗体がアクセスできなかったという仮説が事実であるかを確かめたいだけなのかもしれません。 確認できなかった場合は、沈降はしたが量が少なく、上清ではIPでいくらか持って行かれたため、沈殿ではわずかしか沈降しなかったため、に上清も沈降してきた方も検出限界を下回った、とかでしょうか・ ・・・書きながら思ったのですが、確認できなかった場合、IP作業中のプロテアーゼ等による分解とかは考えられないでしょうか。 > いや、それは根拠が乏しいのではないでしょうか。脂質修飾部位に蛋白が結合していればTX114などのマイルドなdetergentでは外れないかもしれない。 > 一度変性してからTX114で回収してみてはどうかな。 >あとその蛋白は脂質の修飾で(他のタンパク質などの関与がない場合)TX114のフラクションにいくという事は樹立されていますか? TX114で処理した際に、トータルホモジネートではdetergentと水溶性画分の両方に、膜画分ではdetergentの画分に検出されています。細胞質画分は水溶性画分のみに検出されています。

(無題) 削除/引用 No.4489-36 - 2015/10/15 (木) 15:22:48 - おお >確認される可能性を考えています。抗体とうまく結合できていない、ということで。 でならばやる意義があるの? IPされないことはわかってるんですよね。怒っているわけではないんですよ。なんか見えないのです。 >以前の実験者が、細胞質画分にTritonX-114を用いWBを行った際に、水溶性画分において脂質修飾されたのと同じ分子量のバンドを検出しております。 >このことから、分子量は同じであるが、脂質修飾ではない、と考えています。 いや、それは根拠が乏しいのではないでしょうか。脂質修飾部位に蛋白が結合していればTX114などのマイルドなdetergentでは外れないかもしれない。 一度変性してからTX114で回収してみてはどうかな。あとその蛋白は脂質の修飾で(他のタンパク質などの関与がない場合)TX114のフラクションにいくという事は樹立されていますか?スレが長くなってきたのでもしかしたらどこかですでにかかれてるのが思い出せなくなってるだけかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4489-35 - 2015/10/15 (木) 15:06:36 - som > IPする前のcytosolicフラクションのサンプルにlipid modificationのバンドもあるということなので、IP後の残ったフラクションを見る意味はなんでしょうか。そのフラクションでlipid modificationのバンドが確認されるだろうと思いますが、確認されない可能性を考えているのでしょうか。その場合どの様な解釈をお考えなのでしょうか。 確認される可能性を考えています。抗体とうまく結合できていない、ということで。 ただ、その理由が膜画分も、細胞質画分も同じなのか、というのが微妙だと思っています。 以前の実験者が、細胞質画分にTritonX-114を用いWBを行った際に、水溶性画分において脂質修飾されたのと同じ分子量のバンドを検出しております。 このことから、分子量は同じであるが、脂質修飾ではない、と考えています。 膜画分に界面活性剤処理をし、IPができたとしたら、目的タンパクが可溶化できていなかった、と考えられると思います。しかし、細胞質画分はどう解釈できるのか、と考えています。そのため、細胞質画分に界面活性剤処理をし、IPができた際にこれは、膜画分のコンタミ（脂質修飾されたものの検出）とみなされないかを気にしていました。

(無題) 削除/引用 No.4489-33 - 2015/10/15 (木) 14:40:03 - おお IPする前のcytosolicフラクションのサンプルにlipid modificationのバンドもあるということなので、IP後の残ったフラクションを見る意味はなんでしょうか。そのフラクションでlipid modificationのバンドが確認されるだろうと思いますが、確認されない可能性を考えているのでしょうか。その場合どの様な解釈をお考えなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-32 - 2015/10/15 (木) 14:12:25 - たていす >方法としては、IPの上清（いつもは捨てていました）を使ってWBし、 >脂質修飾されたバンドが検出されるか確認すれば良いのでしょうか。 そのとおりです。 薄すぎて検出できないのであれば、TCA沈殿などで濃縮する必要があるかもしれませんが、それはそれでハードルがあります。 沈殿なしでWBできると良いですね。 IPの上清を「いつもは捨てていた」そうですが、安心できるまで捨てるべきではないですね。 １）IPしようと思っている画分（膜だったり可溶性だったり） ２）抗体やビーズを添加する直前の抽出液（これがIP実験のtotalでしょ） ３）IPされなかったIPの上清 ４）IPされたタンパク を相互に比較することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.4489-31 - 2015/10/15 (木) 13:50:40 - som > 検出できない分子量のバンドが脂質修飾されている（？）のだとして、脂質修飾されたタンパクのうちには、低温・tritonx100耐性であるラフトに局在化するものがあるでしょう。IPするときの遠心、もしくはIPする前の抽出液を調製するときの遠心で、フロートアップしている可能性も、一応考えておくと良いかもしれません。 以前の実験者が、細胞質画分にTritonX-114を用い、WBを行っています。その際に脂質修飾されたのと同じ分子量のバンドを水溶性画分において検出しております。 このことから、細胞質画分において分子量の差をもって検出されるバンドは、膜画分のコンタミや脂質修飾によるものではないのでは、と考え、では何による差なのかを探ろうと実験を進めています。 しかし、この"フロートアップ"されていた場合、TritonX-114を用いた際に水溶性画分に分画されてしまうのでは、と気になりました。どうなのでしょうか？ > いずれにしても、脂質修飾されたらしいバンドがIPできていない証拠は、IPした際の素通りに脂質修飾されたらしいバンドが見えることでしょうね。 方法としては、IPの上清（いつもは捨てていました）を使ってWBし、脂質修飾されたバンドが検出されるか確認すれば良いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-30 - 2015/10/15 (木) 13:33:46 - おお ラフトだと超遠心で除けそうだけどそうでもないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4489-29 - 2015/10/15 (木) 13:05:56 - たていす > 今は、IPをすると、脂質修飾された方の分子量のバンドが検出されない、といった状態です。 長引いているね。 検出できない分子量のバンドが脂質修飾されている（？）のだとして、脂質修飾されたタンパクのうちには、低温・tritonx100耐性であるラフトに局在化するものがあるでしょう。IPするときの遠心、もしくはIPする前の抽出液を調製するときの遠心で、フロートアップしている可能性も、一応考えておくと良いかもしれません。 いずれにしても、脂質修飾されたらしいバンドがIPできていない証拠は、IPした際の素通りに脂質修飾されたらしいバンドが見えることでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.4489-28 - 2015/10/15 (木) 12:42:36 - おお >[Re:27] somさんは書きました : > TritonX-114を用いることは検討したことがあります。ただ、仮に水溶性画分において界面活性剤の作用でIPが可能になったとして、Triton X-114を用いた際の水溶性画分にも界面活性剤の作用が施されるているものなのでしょうか。 > ここら辺の知識が不足しておりまして・・・ご教授願います。 何ともいえませんけど、わざと細かいことを書きません。というのはどうやら後半の記述にどうやら重要なことが潜んでいるかもしれないと思えるからです。 > はい、分子量の差として現れます。 > 細胞質画分にもわずかに脂質修飾された際と同様の分子量の差をもったバンドが検出されるため、これが何によってあらわれる差なのかを探っています。 > 今は、IPをすると、脂質修飾された方の分子量のバンドが検出されない、といった状態です。 > まずこれをはっきりさせないと何時までも懸念が拭えないのではとおもいました。まずlipid modificationされているものがIPできないわけで、おそらく物理的に抗体がその抗体認識部位にアクセスできないのだろうと思えます。で一つの可能性は膜フラグメントがまだ残っているという考え方ですが、もしかしたらlipid modificationされた部位が何らかの蛋白で認識されて結合している場合です。detergentsはタンパク相互作用も時に弱めたり切ったりしますからdetergentsでは結論をだしにくいです(おそらくこの辺が質問で一番引っかかっているのではと察します)。 じゃあどうしたらいいか。じっさいむずかしいですね。。。なけなしの知恵をしぼると、lipaseで脂質を消化してはどうだろうかというアイデアにいたりました。lipaseに関して詳しく知りませんのでもし興味がありましたらlipaseによる脂質消化実験などpubmedなどで探してみてはどうでしょう。lipaseでIP可能になれば膜が取り巻いている可能性が高くなります。 また脂質は脱脂したBSAに吸着しますから、ビーズなどにBSAを固定したりしたもので除けたりしないかしらとちょっとおもいましたが、、、

(無題) 削除/引用 No.4489-27 - 2015/10/15 (木) 12:09:15 - som > そういえば、TRITON X-114を使えば膜結合型の蛋白を効率よく除くことができるかもしれません。1-2%ぐらい加えて40度ぐらいにして遠心するとTRITON X-114はそれぐらいの高い温度で不溶性になり、膜蛋白を巻き込んで底にたまります。上層の水層をとれば、膜蛋白が除かれたフラクションを得ることができます。 TritonX-114を用いることは検討したことがあります。ただ、仮に水溶性画分において界面活性剤の作用でIPが可能になったとして、Triton X-114を用いた際の水溶性画分にも界面活性剤の作用が施されるているものなのでしょうか。 ここら辺の知識が不足しておりまして・・・ご教授願います。 > 脂質の修飾は場合によっては電気えいどうで分子量の差で見れたりしますが、対象のものではどうでしょうか? はい、分子量の差として現れます。 細胞質画分にもわずかに脂質修飾された際と同様の分子量の差をもったバンドが検出されるため、これが何によってあらわれる差なのかを探っています。 今は、IPをすると、脂質修飾された方の分子量のバンドが検出されない、といった状態です。

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