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(無題) 削除/引用 No.4474-16 - 2015/10/16 (金) 12:27:44 - hana Mini Kitを使わずにTrizolでいいんではないかと。 Kitを使うなら ・組織を切り分けて、カラムを2〜3本使う。 ・最後に溶かす液量を少なくする or 1本目の溶液で別カラムも溶かす。 とかやっていますが。

(無題) 削除/引用 No.4474-15 - 2015/10/16 (金) 09:20:22 - tana カラム精製だとグリコーゲンが阻害しますよ。 どうしてもカラムを使用したいなら、AGPC後の上清をカラムにアプライしたらよいかと。 あと、クーラーボックスを用意できるのなら、採取した組織をビニール袋に入れた状態で ドライアイスで挟んでそのまま持ち帰るとか。

(無題) 削除/引用 No.4474-14 - 2015/10/15 (木) 20:54:07 - あまの ほかの方も指摘をされていますが、サンプル量が多すぎるという可能性があります。 RNeasy Mini KitのRNA吸着量は最大100 ugと記載されており、suzukiさんの 情報が正しければ肝臓20 mgに含まれるRNA量は上限を超えています。 この場合、組織等に含まれる物質によって、カラムへのRNAの吸着が阻害され る可能性もあるかと。 また、RNA量が少なくて逆転写ができないとのことですが、それはsuzukiさん の実験上RNA量を1000 ngに統一しなくてはならないという意味でしょうか？ 私の経験上、添加するRNA量が1 ugを超えてはならない (過剰量のRNAにより 逆転写効率が下がるため) ということはありますが、少ないから出来ない ということはありません。 もっとも、少なくて目的のRNAを検出できないという可能性はありますが。 さらに言えば、RNA抽出をスピンカラムに頼る必要もないのでは？ たしかにキットは便利ではありますが、それを使わなくてはならないなどと いうこともありません。 また、基礎的な技術を知らなければ問題を解決する力も尽きませんからね。 とにかく、ここまでの流れを見る限りもう少々基礎を学ばれたほうが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4474-12 - 2015/10/12 (月) 01:29:17 - tokyo 屠殺を頚椎脱臼で行う。 肝臓では試したことありませんが、脾臓では常識なようです。 わたしは知りませんでした。 それまでは、麻酔剤の過剰投与をしていたのですが、たしかに頚椎脱臼のほうが収量があがりました。

(無題) 削除/引用 No.4474-11 - 2015/10/11 (日) 23:46:01 - み 肝臓ならｸﾞﾘｺｰｹﾞﾝのｺﾝﾀﾐが気になる 昔の記憶だけどﾄﾘｿﾞｰﾙの説明書にも書いてなかったかな わざわざ絶食するほどでもないだろうし、実際はﾄﾘｿﾞｰﾙでは大量にRNA回収できるしなあ。 カラム精製でｸﾞﾘｺｰｹﾞﾝが問題になるかは知らないけど 参考まで

(無題) 削除/引用 No.4474-10 - 2015/10/08 (木) 22:39:06 - おお 260/230の問題ならエタチンを一度すると精製過程で混入するグアニジンなどは除けます。肝臓だともしかするとヘムや鉄イオンなどが原因で260/230が動いているかもしれません。最近のUV測定の機器はリファレンスなしに吸収の平たい領域や決められた波長をベースラインに選定してオートで算出したりするので、可視に吸収があると変な値を出すことがあります。 また分解の可能性は一度疑った方がいいと思いますが確認してますでしょうか。 RNAlater使った場合の抽出は状態から考えてちょっとコツがあるかもしれませんね。私は使いませんのでわかりませんけどその辺りアドバイスがあればいいですね。

(無題) 削除/引用 No.4474-9 - 2015/10/08 (木) 20:36:59 - AP OD260で核酸の定量、ratio OD260/OD280が純度の指標(タンパク質の夾雑により2.0より小さくなっていく)ですね。OD230はフェノール、グアニジンのほかポリフェノールの夾雑の指標で植物では重視する向きもあるようですが、動物では重視されないと思いますよ。260/230が1.0より低いと問題ありと判断されるようです。

(無題) 削除/引用 No.4474-8 - 2015/10/08 (木) 19:48:18 - alpha suzukiさんが仰ることが本当なら口出し出来るレベルではないんですが、、、 ふみさんが仰るように260/230ではないのでは？ あと、まさかとは思いますが、RNAlaterのままホモジナイズしてないですか？ そんなことはないですよね。 RNeasy Mini kitって書かれてますしね。。。 もし本当に肝臓の重量が20mg程度あるのであれば、多すぎて困るぐらいです。 きちんとプロトコールを確認されることをおススメします。

230 or 280 ? 削除/引用 No.4474-7 - 2015/10/08 (木) 19:26:08 - ふみ "成功したときは2近くまでいくはず"ということなら、230ではない気がします。 それが悪いならば、私が先ほどおすすめしたことを試してみるのがよいと思いますよ。 それか、スターティングマテリアル（肝臓サンプル）の重量をきちんと測ってみて、説明書のトラブルシューティングの頁をよく読んでみるか。

(無題) 削除/引用 No.4474-6 - 2015/10/08 (木) 19:15:55 - suzuki 定量はBioSpecnanoでUVにより定量しています。ホモジナイズに気をつけてもう一度やってみたいと思います。 OD260/230はバッファーなどの混入によるものだと思います。成功したときは2近くまでいくはずなんですが失敗したときと違いがわかりません。。

ちょっと提案 削除/引用 No.4474-5 - 2015/10/08 (木) 18:36:12 - ふみ 3 mm x 10 mm 程度の小さな切れ端と、いつもの大きな切れ端(あるいは肝臓全部)と、それぞれをRNAlaterに放り込んで、小さな切れ端からRNA抽出をやってみたらどうでしょうか。 RNA抽出の最初の試薬は400 microL程度でよいと思います。 それとは別に気になることがあります。 OD260/230は破砕に用いた液体中の試薬が混入したかの指標ですか？

(無題) 削除/引用 No.4474-4 - 2015/10/08 (木) 18:35:17 - AP まだ実際の収量が書かれていないんですが。それでは、どれほどの重症度なのかわかんないんですよね。 まっ、それは置いといて、 RNeasy添付マニュアルにあるトラブルシュートは検討したんでしょうか。 それで幾許かの改善は見られましたか？ それ以上のアドバイスは、そばで実際に見てみない第三者には出来ないんじゃないでしょうか。 一番怪しいのはホモジナイズです。どうしても手の違いが出てしまいますし、収量にあたえるインパクトが大きいところです。サンプル中のRNAの分解はみんな注意しているでしょうから、最近じゃその辺でコケることはまずなくなっていると思います。分解が起こっていたとしてもRNAの収量自体が減るくらいめちゃくちゃに分解するというより、吸光度で読んだ収量は標準的だけれど、泳動などで定性的にしらべると、実際は分解が起こっていてrRNAのピークが甘くなっているなどでしょう。 あと、定量値はどういう方法で出したんでしょうね。吸光度はそれほどあてになりません。

(無題) 削除/引用 No.4474-3 - 2015/10/08 (木) 17:41:00 - suzuki 情報が不足していましたすみません。 スターティングマテリアルの重量は２０−３０mg程度で通常マウス肝臓には１gの組織当たり6.6mgのRNAが抽出できるはずだと思います。逆転写は溶液20μL中に1000ngのRNAが入っていることが条件なので逆転写を行えずにいます。

(無題) 削除/引用 No.4474-2 - 2015/10/08 (木) 17:21:29 - AP >核酸濃度が10ng/μL程度しか出ず困っています。 収量の問題を論議するなら、収量、収率がわかる書き方をしなきゃ。 スターティングマテリアル（肝臓サンプル）の重量は？ RNAの総収量は？　 収量が少ないと言われても、スタート材料の量に因るだろうし（少ないなら必要なだけスケールアップしたらよかろう、ということになる）、濃度で言われてもそんなの全体積がいくらか次第だし（濃度が薄いのが問題なら濃縮すりゃいいんじゃんということになる）。 逆転写がおこなえないとは、やったけど失敗したということ？ 逆転写に供するだけの自己基準に達していないということ？ 目的によるけれど、単純に収量の問題だけなら（同時に品質も劣っているとかでなければ）、先に進んでもいいんじゃないか。

マウス肝臓からRNA抽出 削除/引用 No.4474-1 - 2015/10/08 (木) 17:01:41 - suzuki マウスの肝臓からRNA抽出をし、逆転写し、RTーPCRを行っています。 解剖後即座にRNAlaterにいれてクーラーボックスにいれて持ち帰りミキサーで破砕したあとRNeasy Mini Kitを用いてRNAを抽出していますが、核酸濃度が10ng/μL程度しか出ず困っています。 抽出では卒業された先輩が行っていたプロトコルをそのまま用いていますが核酸濃度が低く、またOD260/230も大変低く逆転写が行えません。 過去に同じ実験をされていた先輩は卒業されていていらっしゃらないので聞ける人もいなくて困っています。詳しい方がいらっしゃいましたら考えられる原因を教えてください。お願いします。

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